基因工程菌发酵..ppt

第八章 发酵工程在现代生物技术中的应用 第一节 基因工程菌发酵 第一节 基因工程菌发酵 一、基因工程基本知识 基因工程(genetic engineering)的定义 基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物体(供体)的基因或基因组提取出来．或者人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体(受体)的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。又称重组DNA技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。 工程菌的应用 1、基因药物 例如，红细胞生成素、胰岛素、干扰素、乙肝疫苗、生长激素和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等。 2、其它发酵产品 例如酶制剂、氨基酸（苏氨酸、色氨酸）、抗生素等。 （一）载体 载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制。 （二）载体DNA与外源基因片段的连接 （三）目的基因导入受体细胞 （四）转化细胞的筛选及表达产物的鉴定 1、重组体的筛选 2、表达产物的鉴定 二、基因工程菌的发酵 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。 （一）质粒的稳定性 1、质粒不稳定的类型 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化 2、质粒不稳定产生的原因 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； 这两种菌比数率差异的大小。 对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数： 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性； 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。 3、质粒稳定性的分析方法 样品 4、影响质粒稳定的因素 与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响； 宿主对质粒稳定的影响； 质粒拷贝数； 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响。 5、使质粒稳定的措施 组建合适载体 选择适当宿主 施加选择压力 – 抗生素添加法 – 抗生素依赖变异法 – 营养缺陷型法 控制基因过量表达 控制培养条件（温度、pH、DO） 为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用两阶段培养法： ⑴先使菌体生长至一定密度； ⑵再诱导外源基因的表达。 由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。 （二）工程菌发酵工艺 基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同,基因工程菌带外源基因,发酵的目的是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。 1、工程菌培养的特点 工程菌工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模为低。 为提高工程菌体表达效率，需采取适当措施，提高重组DNA在受体细胞内的拷贝数及促进表达产物自细胞内向细胞外分泌。 工程菌体的原宿主通常是某些培养物质(如某种氨基酸或维生素等)的缺陷型，有些基因工程细胞生产过程亦产生某些抑制细胞生长的代谢物。在培养过程中应考虑控制培养液营养成分及其浓度，同时采取措施，消除抑制细胞生长的代谢物，以保证细胞正常生长。 2、工艺要求 外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有： （1）培养基的影响 （2）接种量的影响 （3）温度的影响 （4）溶解氧的影响 （5）诱导时机的影响 （6）pH的影响 （1）培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。 常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等。 不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。 使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。 葡萄糖对lac启动子有阻遏作用。乳糖对lac启动子有利。 在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对trp启动子控制的基因有影响。 无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。 （2）接种量的影响 接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。 接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。 接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。 接种量过高，使菌体生长