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实验结果示意图 IPTG诱导表达His-GFP融和蛋白（31.9kD）。 1为诱导前，2～6分别为诱导0.5, 1, 1.5, 2, 2.5hrs。 诱导不同时间目的蛋白表达量检测结果 BoIL-18在sf9昆虫细胞中的表达 1:感染重组杆状病毒的sf9的培养上清 2:感染重组杆状病毒的sf9的裂解沉淀 3:正常sf9的裂解上清 4-6:感染重组杆状病毒48、72、96 h的sf9的裂解上清 7:蛋白质marker 5、Ni柱亲和层析 注射器内加满结合缓冲液，连接好检测器，调节流速2ml/min。 将柱料及样品溶液用滴管加入注射器内，上柱，收集流出液40ul留样4。 结合缓冲液再洗5个柱床体积，流速2ml/min。 50mmol/L的咪唑洗脱液洗脱5个柱床体积，流速2mL/min，收集洗脱峰50ul留样5。 100mmol/L的咪唑洗脱液洗脱5个柱床体积，流速2mL/min，收集洗脱峰50ul留样6。 第二天实验第二部分 200mmol/L的咪唑洗脱液洗脱5个柱床体积，流速2mL/min，收集洗脱峰50ul留样7。 300mmol/L的咪唑洗脱液洗脱5个柱床体积，流速2mL/min，收集洗脱峰50ul留样8。 500mmol/L的咪唑洗脱液洗脱5个柱床体积，流速2mL/min，收集洗脱峰50ul留样9。 用去离子水洗5个柱床体积，再用20％乙醇洗3个柱床体积，流速为2mL/min，将柱子封存于4℃冰箱，留待下组实验使用。 6、破碎及层析效果检测 凝胶制备制备两板胶备用 分离胶和浓缩胶分别按表中的配方进行制备。先制分离胶，将分离胶注入玻板后，用去离子水封口，约30－40min后凝聚。将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子，胶凝固后放入一次性手套内密封，保存于4℃冰箱内，以备第二天使用。 单位/ml 10% 分离胶 5% 浓缩胶 去离子水 2.6 1.7 丙烯 酰胺 1.7 0.5 Tris 溶液 pH8.8 0.6 pH6.8 0.76 10% SDS 0.05 0.02 10% AP 0.05 0.02 TEMED 0.003 0.003 第二天实验第三部分 破碎及层析效果检测 凝胶电泳 取30 ml 电极缓冲液分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中。 留样样品内加入50uL的2×SDS凝胶加样缓冲液，混合均匀后沸水浴5min，点动离心，准备上样。 在加样孔中加入15ul已经处理好的蛋白样品。 20 mA、60V电泳50min。 点样顺序 电泳结束后染色20min，脱色至脱色液基本无色，背景透明无色，样品条带清晰，照相。 第一道 Marker 第二道 样品1 第三道 样品2 第四道 样品3 第五道 样品4 第六道 样品5 第七道 样品6 第八道 样品7 第九道 样品8 第十道 样品9 第三天实验第一部分 7、Western Blot 7.1 SDS凝胶电泳 取30 ml 电极缓冲液分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中。 在加样孔中加入15ul已经处理好的蛋白样品。 样品点两个相邻孔道，隔一个泳道点Marker。 20 mA、60V电泳50min。 停止电泳 先将玻璃板撬掉才可以剥胶，将浓缩胶轻轻刮去，最后将溴酚蓝的前沿切下。 再将两侧的空白泳道切下不要，沿中间空白用刀将样品和Marker分开。 Marker泳道正常染色脱色，样品泳道进行转膜。 第三天实验第二部分 Marker 样品一 样品二 分离胶 浓缩胶 溴酚兰前沿 Marker 样品一 样品二 分离胶 浓缩胶 溴酚兰前沿 Marker 样品一 样品二 分离胶 浓缩胶 溴酚兰前沿 Marker 样品一 样品二 分离胶 浓缩胶 溴酚兰前沿 Marker 样品一 样品二 分离胶 浓缩胶 溴酚兰前沿 Marker 样品一 样品二 分离胶 浓缩胶 溴酚兰前沿 Marker 样品一 样品二 分离胶 浓缩胶 溴酚兰前沿 正常染色、脱色 进入转膜、免疫、显色操作 7.2 电 转 膜 样品凝胶放入转移缓冲液中浸泡15min。 按照凝胶大小剪取等大的硝酸纤维素膜，也浸泡在转移缓冲液中15min。将凝胶与硝酸纤维素膜重合，在左上角剪个小口做标记。 再剪取同样大小的两张厚滤纸，使用之前要在转移缓冲液中浸泡一下，滤纸不要比凝胶和膜大，以免短路。 将转移电泳槽中的夹子打开，也浸泡在转移缓冲液中。白色一面在底下，在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒来回擀几遍以擀走里面的气泡，在垫子上垫滤纸，一手固定滤纸，一手用玻璃棒擀去其中的气泡。 第三天实验第三部分 接着放上硝酸纤维素膜，再放上凝胶，凝胶之上再放滤纸。滤纸，膜，凝胶和滤纸之间要对整齐。最后盖上另一个海绵垫，擀几下后合起夹子。整个操作在转移缓冲液中进行。 将夹子放入转移槽中，要使夹子的黑面对应阴极，夹子的白面对应阳极。电转移时会产