精品重组人神经型一氧化氮合酶课件_2.ppt

重组人神经型一氧化氮合酶催化阿霉素单电子还原的研究 导 师：赵迎社 副教授 井柳尧 教授(日本) 研究生：付 捷 专 业：生物化学与分子生物学 研究背景 1，人类神经型一氧化氮合酶的结构和功能特征； 2，醌类药物阿霉素的心肌毒性与一氧化氮合酶催化的单电子还原有关。 哺乳动物体内的一氧化氮 （NO） 和一氧化氮合酶 （NOS） 人神经型一氧化氮合酶 (hnNOS) 的结构 hnNOS 中的电子传递 1，FMNH2是电子传递过程中的主要活性形式； 2，空气稳定半醌 (FAD-FMNH.) 是该黄素对在体外有氧条件下的稳定存在形式； 3，钙离子/钙调蛋白结合能促进分子内电子传递。 醌类药物的致病机制 研究目的 1,构建重组人神经型一氧化氮合酶的表达系; 2,阐明人类神经型一氧化氮合酶催化阿霉素单电子还原的机制。 技术路线及实验方法 实 验 结 果 构建 hnNOS 的原核表达系 分子克隆产物鉴定（1） 分子克隆产物鉴定（2） 纯化 hnNOS hnNOS 全长的光学特性 （1） hnNOS 全长的光学特性（2） hnNOS 还原电子受体反应的表观动力学常数 小结 1，用于细胞色素P450还原酶的原核表达系同样适用于人神经型一氧化氮合酶全长酶； 2，重组人神经型一氧化氮合酶与鼠神经型一氧化氮合酶的性质相似。 第二部分 重组人神经型一氧化氮合酶催化阿霉素单电子还原的研究 纯化 hnNOS FAD/NADPH, FAD/FMN 结合结构域，辅酶钙调蛋白(CaM) hnNOSs 还原醌类药物反应的表观动力学常数 1，hnNOS 的氧化酶结构域对催化醌类药物的单电子还原作用没有明显影响； 2, 在 Ca2+/CaM 存在的条件下，FMN 是FAD/FMN 结合结构域和全长酶还原醌类药物的主要电子供体。 Ca2+/CaM 的结合作用 阿霉素与过氧化物 SOD 对 hnNOSs 氧化血红蛋白生成的作用 hnNOS FAD结合结构域对阿霉素的还原作用 hnNOS FAD/FMN 结合结构域对阿霉素的还原作用 1，hnNOS 上结合的 FMN 半醌难与阿霉素反应； 2，空气稳定半醌（FAD/FMNH. ）是 hnNOS 还原阿霉素反应过程中的主要中间产物。 小结 1，重组人神经型一氧化氮合合酶可以催化阿霉素的单电子还原反应； 2，在钙离子/钙调蛋白存在的条件下，单电子受体阿霉素主要从FMN处接受电子； 3，双电子还原半醌（FADH2-FMN或FAD-FMNH2），和三电子还原半醌（FADH2- FMNH.或FADH.–FMNH2）是反应中的活性形式，均可以迅速传递一个电子给受体 ； 4，钙离子/钙调蛋白通过加速分子间电子传递，促进酶对阿霉素的还原作用。 结论 1，在大肠杆菌中成功构建重组人类神经型一氧化氮合酶的表达系，及纯化方法； 2，如同细胞色素P450还原酶，人类神经型一氧化氮合酶在醌类药物生物转化过程中也起着重要作用； 3，根据实验结果，我们提出了 FAD-FMN 在反应中的电子传递模式图。 FAD-FMN 对中的电子传递模式图 已发表文章 1，Jie Fu, Keita Yamamoto, Zhi-Wen Guan, Shigenobu Kimura, and Takashi Iyanagi, Human neuronal nitric oxide synthase can catalyze one-electron reduction of adriamycin: Role of flavin domain，Archives of Biochemistry and Biophysics, in press. 2，Fu Jie, Zhou Yu-bing, Zhao Ying-she, Guan Zhi-wen, Iyanagi Takashi, Construction of human neuronal nitric oxide synthase expression system in Escherichia coli, Chinese Journal of Pathophysiology, 6 (2004). 3, 付捷，周羽竝，冯建生，赵迎社，混合型高脂血症患者脂蛋白酯酶基因第6外显子基因突变的研究，广东医学，25 (2004)7。 * 硕士学位毕业论文答辩 L-精氨酸 + O2 一氧化氮合酶（NOS） NADPH 瓜氨酸 + NO 神经冲动传导 血压调节 免疫应答 同工酶 神经型NOS (nNOS) 内皮型 NOS (eNOS) 诱导型 NOS (iNOS) 表达方式 主要调节方式 组成型表达 组成型表达 诱导型表达 钙离子浓度 磷酸化 诱导因子 分子量 160 k