《分子生物学常用技术在中医药研究中的应用》实验课 07 组织总RNA提取（18P）课件.ppt

* * 实验 17 组织总RNA提取 目 的 1．了解某一特定组织或细胞某一特定 mRNA 转录量的变化，如 RT-PCR、Northern blot 等。 2．了解某一特定组织或细胞全部 mRNA 转录量的变化，如 DD-PCR、基因芯片等。 3．获得某一特定组织或细胞全部 mRNA，以便建立 cDNA 库等。 4．获得某一特定组织或细胞全部 RNA。 以上工作的前提是制备纯净且完整的 RNA。 现代医学研究表明，人类的绝大多数疾病都是由若干基因表达的改变所引起的。根据生物学“中心法则”原理，基因的表达包括转录与翻译两个阶段。其中，由 DNA 到 RNA 的转录过程受到各种因素的调节，其调节水平反映出某种或某些特定的因素对相关基因表达的调节能力。已有的研究一再表明，中医药所发挥的治疗与预防作用是直接或间接调整了基因的转录而实现的。 RNA 主要由 rRNA（占总量的 80～85％），tRNA 和核内小分子RNA（占总量的 10～15％）以及mRNA（占总量的1～5％）所构成。理论上认为每克组织（或108个培养细胞）可提取 5～10 mg RNA。 提取总 RNA 的方法有多种，比如： （1）本实验介绍的方法，采用 Trizol 试剂，或类似的方法，称为一步法，方便而快捷。缺点是 RNA 的获得量偏低，质量不够纯净。 （2）超离心方法，可以获得丰富且质量高的RNA。缺点是实验时间比较长，要求离心过夜。 （3）其它一些试剂盒，主要是利用某些特定的介质吸附 RNA，洗去其它杂质，最后洗脱纯净的 RNA。可以在短时间内获得纯净的 RNA。但是价格比较昂贵。 原 理 本实验类似于“异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法”。方法采用强 RNA 酶抑制剂异硫氰酸胍，抑制 RNA 酶的活性，防止 RNA 降解；酚/氯仿使蛋白质变性。离心后，RNA 选择性地进入无 DNA 和蛋白质的水相。之后通过异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤等，便可得到较为完整与纯洁的总 RNA。 实验准备 实验步骤 ——参照GIBCO BRC公司有Trizol试剂盒。 1．引颈处死小鼠，剖腹切取肝脏组织50mg（或106-107个细胞），加入1ml Trizol 液，剪碎，快速匀浆。 2．22℃，静置5min。 3．加入氯仿 0.2ml，颠倒 15s。 4．22℃，静置 3min。 5．离心：4℃×15000 转/分× 15min。 6．取上清液 0.45ml。 7．加入 0.45ml 异丙醇，混匀。 8．22℃，静置 10min。 9．离心：4℃×15000 转/分×10min。 10．弃上液。 11．加入 1ml 4℃ 75%乙醇。 12．离心：4℃×10000转/分×5min。 13．弃上液，真空干燥 5min。 14．用高压消毒过的去离子水 25ul 水冰上溶解，-70℃保存。 15．紫外分光光度计测定 RNA 的含量： 取样本 5ul 加入石英比色杯内，加入蒸水 1ml，充分混匀。与蒸水对照。读 260nm、280nm 两个测得值，记录。计算： OD260为1时，为40ug RNA，所以计算如下： 样本RNA含量（ug/ul）= OD260×200×40/1000 当OD值260/2801.8时，提示有蛋白或酚的污染。 实验结果 得到比较纯净的肝组织总RNA。 据参考文献，分光光度计读数 260/280 值为 1.85±0.04。 注意事项 1．实验过程中要求创造一个无 RNA 酶污染的环境。主要包括两个方面的工作： 其一，极力避免来源于操作者的手及实验的器皿和试剂等外源性 RNA 酶的污染； 其二，尽力抑制组织细胞中内源性 RNA 酶的活力，并尽可能地去除。 2．由于 RNA 酶到处存在，不易失活，极易造成污染而导致 RNA 的降解，造成实验失败。因此建议所有用品均应严格按要求消毒，注明 RNA 专用。严格按无菌操作要求操作。通常用于 RNA 抽提与保存的塑料制品用 DEPC 水室温下浸泡过夜，再高压消毒。 注意，DEPC处理的水和容器，必须高温灭活DEPC，以免其日后抑制其它酶的活性，导致实验失败。玻璃制品泡酸反复冲洗后，250℃干烤 3 小时以上。 3．去除内源性 RNA 酶的方法可用酚/氯仿反复抽提几次，直至中间的蛋白层基本消失。我们的经验是至少抽提 3 次以上。 4．实验过程中应将组织充分匀浆，一般可先将组织块用剪刀剪碎，以利于快速匀浆。 5．在酚/氯仿抽提过程中，一定要颠倒混匀充分，这样才能使蛋白质充分变性，才能充分去除蛋白质与 RNA 酶。为了提高 RNA 的纯度，该步骤可以重复若干次。 * *