分子机器在肿瘤标志物测中的应用研究.doc

分子机器在肿瘤标志物检测中的应用研究 摘 要 MicroRNAs (miRNAs)是一类内生的非蛋白编码RNA分子，大约18-24核苷酸长在植物人类和动物的组织中都有发现通过与mRNA 3′端非编码区绑定结合导表现致mRNA退化或者抑制所以miRNAs在转录后基因调控中扮演着重要作用。miRNAs在癌症检测和键入方面有着重要意义发展灵敏的、特异性的、定量的、低成本的检测miRNAs的方法是很有必要的。分子信标（MB），一种专门设计的DNA发夹结构，已经被广泛的运用于生物传感器的发展，DNA、RNA、蛋白质、金属离子甚至肿瘤细胞等靶的分析检测。 本文主要开展了以下两个方面的工作： 基于哑铃型探针滚环-剪切-复制技术检测 mRNA 的研究 本章基于哑铃型探针滚环-剪切-复制技术，建立了一种高效的超灵敏免标记检测 miRNA的方法（以let-7a miRNA作为分析物）。该方法通过哑铃探针绑定目标 miRNA环化，进而引发滚环循环放大（RCA）和一个自发的剪切-聚合-取代分子机器过程，生成大量的可与hemin结合，以ABTS-H2O2为反应底物，产生紫外-可见信号。本方法灵敏度高(检测限可达1 zmol)、线性范围宽(可达个数量级)、特异性号(可检测单碱基错配)、操作简单(仅需一个探针和三种酶)，并成功应用于let-7a miRNA实际样品的检测(人体肺部组织总RNA)，为 miRNA用于基因表达和分子诊断，特别是癌症早期诊断提供了一种新方法。 基于自组装DNA分子机器循环放大技术检测DNA、Rmos 细胞、溶菌酶的研究 本章基于自组装DNA分子机器循环放大技术，建立了一种高效的检测DNA的方法，该方法通过靶DNA与茎环1反应打开茎环，再与茎环2、circle1杂交成环，在DNA聚合酶和DNA内切酶存在下，一边发生滚环复制，一边发生DNA剪切-复制扩增，生成大量DNA模拟酶，与hemin特异性结合，以ABTS-H2O2为反应底物，产生紫外-可见信号。从而实验了对DNA的免标记的高灵敏检测，并进一步将此方法运用到了Rmos细胞、溶菌酶的检测。DNA分子机器、MicroRNAs、分子信标application of DNA molecular machine in the amplified dection of Tumor markers ABSTRACT MicroRNAs (miRNAs), a class of endogenously non-protein coding RNA molecules about 18-24 nucleotide long, that can be found in plant, human, and animal tissues play key roles in post-transcriptional gene regulation through binding to the 3′ UTR of mRNA targets, resulting in mRNA degradation or repression. Considering the great significance of microRNAs (miRNAs) in cancer detection and typing, the development of sensitive, specific, quantitative, and low-cost methods for the assay of expression levels of miRNAs is desirable. Molecular beacon (MB), specifically designed DNA hairpin structure, has been widely applied in biosensor development, achieving the detection of a broad range of targets from DNA, RNA, protein, metal ion to even tumor cells. This thesis can be summarized as the following two parts. 1、Dumbbell Probe-Mediated Cascade Isothermal Amplification for Label-Free Detection of Zeptomole microRNA and Its Application to Real Sample Assay We describe a highly efficient amplification