埃博霉素的生物合成与埃博霉素D内酰衍生物的半合成研究.docVIP

埃博霉素的生物合成与埃博霉素D内酰胺衍生物的半合成研究 阎家麒 （湖北荆工药业有限公司，湖北 京山431800） 摘 要 粘细菌纤维堆囊菌ATCC15384在发酵培养中使用P450埃博霉素环氧酶的一种抑制剂，该抑制剂特异性抑制epoK基因产物的生成。重组纤维堆囊菌的 epoK基因因随机诱变而失活，由于埃博霉素聚酮合酶（PKS）基因编码的改变，生产菌株只产生埃博霉素D和C，而不产生埃博霉素A和B。快速色谱纯化得到埃博霉素D，以其为起始材料采用区域性-立体选择性钯催化大环内酯氮化反应半合成埃博霉素D内酰胺衍生物。 关键词 埃博霉素D内酰胺衍生物；埃博霉素D；粘细菌纤维堆囊菌；生物合成；埃博霉素基因簇；聚酮合酶 埃博霉素 (epothilones）是纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum,Myxococcales)[1]，埃博霉素具有水溶性好，注射、口服均可在P-糖蛋白表达型的多药耐药性（MDR）细胞中也维持很大的细胞毒性埃博霉素公认为本世纪将取代紫杉醇的最有效的抗癌药物。 Fig 1 Structures of epothilones A,B and Taxol 作者简介：阎家麒，1939年生，男，辽宁营口市人，教授，中国药学会高级会员，主要研究领域：生物制药和复杂结构天然药物有机合成。联系电话：1346789911， E-mail: yanjiq99@126.com 2-5]，但产率低微尚无工业化应用价值。目前，已有5种埃博霉素类似物进入II 和III期临床试验，它们是埃博霉素B、埃博霉素D、Ixempa（ixabelilone）、ZK-EPO和BMS-310706。埃博霉素D内酰胺衍生物(Aza-epothilone D)是一种埃博霉素重要的衍生物，实验证明它具有较强的抑制微管解聚功能 是一种候选抗癌药物。埃博霉素D内酰胺衍生物结构式如图2： 作者以粘细菌纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum ）ATCC15384为出发菌株，使用一种化学合成的抑制剂，使得epoK基因（P450环氧酶）发生突变，得到一个含有失活epoK基因的纤维堆囊菌突变菌株埃博霉素抑制 C12-C13环氧化反应，使得埃博霉素C和D向埃博霉素A和B的转化受到遏制，因而只产生埃博霉素C和D而不产生埃博霉素A和B。以纯化后的埃博霉素作为起始原料，经立体选择性三苯基膦钯催化大环内酯氮化反应，促使埃博霉素开环，得到一种氮酸，再经三甲基膦处理，生成亚氨基正膦，经水解成为氨基酸。最后用HOBt-EDCl促进氨基酸环化反应，得到标的的埃博霉素D内酰胺衍生物。 1.1 菌种和EpoK抑制剂 出发菌株为粘细菌菌株中的纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）ATCC15384, 从美国菌种保藏中心得到。 epoK抑制剂为1-(2-甲基-4-噻唑基)-2-甲基己基-1-烯-5-炔-3-乙酸酯，依据文献[]方法合成。 1.2 培养基与菌株 出发菌株接种在固体培养基上，固体培养基成分为：大豆蛋白胨8g/L，马铃薯淀粉20g/L，酵母提取物10g/L , 无水葡萄糖5g/L，CaCl2·H2O 1g/L, MgSO4·7H2O 1g/L, Fe-EDTA 8mg/L, 琼脂粉15g/L。30℃培养5d后，接种至液体发酵培养基。液体发酵培养基成分为：大豆蛋白胨10g/L，马铃薯淀粉20g/L，酵母提取物4g/L , 无水葡萄糖15g/L，CaCl2·H2O 1g/L, MgSO4·7H2O 1g/L, Fe-EDTA 8mg/L，树脂XAD-16 20ml/L。30℃，120，摇床培养4d。加入epoK抑制剂，使终浓度为5.0mmol/L至10.0mmol/L, 在30℃下，120r/min，摇床继续培养7d。 1. 检测培养物中产生的埃博霉素和埃博霉素取培养物50ml，用尼龙筛（孔隙150μm）过滤，用少量水冲洗保留在尼龙筛上的树脂，然后与滤膜一起置于50ml离心管中，加入异丙醇10ml，密封。以180摇动1h，将埃博霉素下来，然后离心分离1.5ml液，将约0.8ml上清液用移液管转移到 HPLC试管中。依据样品的HPLC分析结果埃博霉素C和D在上述相应菌落的部分平皿上用塑料杯将1cm2琼脂区域的细胞转移到10ml G52培养基（马铃薯淀粉8g/L, 葡萄糖2g/L，脱脂大豆粉2g/L，酵母浸膏2g/L，Na-FeIII-EDTA 8mg/L, CaCl2·2H2O 1g/L, MgSO4·7H2O 1g/L, HEPES 11.5g/L,用KOH调节pH 7.4）中，在30℃，180条件下培养7d。将培养物5ml转移到250ml锥型烧瓶中的50ml G52培养基中，在30℃，180培养3d。第一次基因突变获得了缺失