基因工程菌培养,动力学已看..ppt

宿主菌对工程菌的生长优势，对工程菌发酵极为不利。 基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排 影响质粒稳定的因素 与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响 宿主对质粒稳定的影响 质粒拷贝数 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响 培养条件的影响（培养基，温度，pH等等） 稳定基因工程菌的措施 改进重组质粒的结构（增加稳定结构，去除不稳定结构） 选择适当宿主 控制基因的过量表达 选择合适的拷贝数 调节培养条件 增加外界环境压力 施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高 分阶段控制培养 因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制 两阶段培养法： ⑴先使菌体生长至一定密度； ⑵再诱导外源基因的表达 控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度 控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数 优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：采用天然培养基培产时质粒稳定较用合成培养基为高 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定 选择合适拷贝数的菌株 在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量提高。 改进质粒结构 插入促进稳定的DNA片段，删去多余的部分；去除含有转座结构的DNA片段，使用温度敏感性质粒。 固定化 固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性 基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的表达率都有了很大提高。 在大规模生产中往往采用固定化方法 不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。 基因工程菌的安全性问题 美、日等国都制定了有关DNA重组实验的准则，即在试管内用酶等构建异种DNA的重组分子，并用它转入活细胞中的实验，以及使用重组体的实验应遵循的规程。其目的是保证实验的安全和推动重组DNA的研究。这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定，采用物理密封(P1~P4)和生物学密封(B1和B2)两种方法。 物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。 生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。 企业中进行重组菌培养时的设备标准有LS-1和LS-2。LS-2相当严格，工业生产起码应在LS-1的设备标准下培养。LS-1标准要点是：(1)使用防止重组菌体外漏，能在密闭状态下进行内部灭菌的培养装置； (2)培养装置的排气由除菌器排出； (3)使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。设计用于基因重组菌的培养装置时，不仅要考虑外部杂菌的侵入，还要防止重组菌的外漏。此外，培养后的菌体分离、破碎等处理也必须在安全柜内进行，或是采用密闭型的设备。 在普通通气搅拌罐中可能发生外漏的部位和操作。归纳起来有： 排气， 机械密封， 接种， 取样， 培养后的灭菌(通入湿热蒸气)， 排液(输至下一工序)。 基因工程菌发酵的后处理技术 传统的发酵产品和基因工程产品在提取和精制上的不同，主要表现在下列方面： (1)传统发酵产品多为小分子，其理化性能，如平衡关系等数据都已知，因此放大比较有根据；相反，基因工程产品多是大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。 （2）基因工程产品大多处于细胞内，提取前需将细胞破碎，增添了很多困难。而且发酵液中产物浓度也较稀，杂质又多，加上一般大分子较小分子不稳定(如对剪切力)，故提取较困难，常需利用高分辨力的精制方法，如色层分离等。 （3）基因工程产蛋白提取的要求纯度更高，对于安全性的要求更为严格。 细胞的破