分子生物学实验实验2重组粒的提取及鉴定2015.ppt

DNA分子越小，迁移距离越大， 琼脂糖浓度越低，对同样大小的DNA，迁移距离越大，同样的迁移距离下，琼脂糖浓度越低，DNA分子越大，每种浓度的琼脂糖浓度有相应的最适DNA分离范围（线性区段），琼脂糖浓度越低，最适DNA分离的大小越大 * 当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型 若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型 * * TAE 缓冲容量低，成本稍低，较稳定。超螺旋DNA在TAE中分辨率比在TBE中更好，其他情况下分辨率差不多。TBE和TPE缓冲容量高，成本高。 * * 实验二 重组DNA的提取及酶切鉴定 复旦大学基础医学院医学实验教学中心 邵红霞 021 shaohx@fudan.edu.cn * 一、实验目的 掌握以下方法和技术： 1. 质粒DNA的小量快速制备 2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切 3. DNA的琼脂糖凝胶电泳 * 二、实验原理 分离质粒DNA有三个步骤： 1. 培养细菌使质粒扩增 2. 收集和裂解细菌（本实验：SDS裂解） 3. 分离和纯化质粒DNA（本实验：碱变性法） 1. 质粒DNA的小量快速制备 * 碱变性法抽提质粒DNA Solution II pH12.6 Solution III pH4.8 离心后去向 染色体DNA 氢键断裂，双螺旋解开 不能复性 沉淀中 质粒DNA 氢键部分断裂，cccDNA互补链不完全分离 复性 上清中 * 硅基质材料(树脂）与DNA双链相互作用的原理 DNA分子中的磷酸二酯键骨架在盐溶液的作用下脱水，使得暴露的磷酸基团吸附硅胶。双链DNA分子一旦被硅胶吸附，一般的洗液不能将其洗脱下来，只有水溶性的缓冲液，如TE或水重新水化后，DNA才能从层析柱上定量回收。 * 2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切 BamH I + Xba I双酶切（酶切完全时） 琼脂糖凝胶电泳凝胶中2条区带 3.5kb pSV2载体片段 4.8kb c-myc 目的基因片段 pSV-c-myc BamH I Xba I c-myc基因片段4.8 kb pSV2载体片段3.5kb * 琼脂糖——海藻中提取的线状高聚物 加热融化成清澈、透明的溶液 凝固后成凝胶 3. 琼脂糖凝胶电泳 * * DNA在凝胶中的迁移率的影响因素 DNA分子的大小 琼脂糖的浓度 DNA的构象 所加电压 嵌入染料的存在 电泳缓冲液的组成及其离子强度 * * 不同含量标准的琼脂糖凝胶的分离范围 琼脂糖凝胶浓度线状 DNA分子分离范围 （%，m/V） （kb） 0.3 5~60 0.5 1~30 0.6 1~20 0.7 0.8~12 1.0 0.5~10 1.2 0.4~6 1.5 0.2~4 2.0 0.1~3 * 质粒DNA的3种构象 琼脂糖凝胶电泳凝胶中1、2、3条带都有可能 共价闭合环形DNA 开环DNA 线性DNA 存在复制中间体可能 * DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液 * 1%琼脂糖凝胶电泳中： 溴酚蓝迁移速率约与300bp的线状双链DNA相同； 二甲苯氰FF约与长4000bp的DNA相同 增加样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔里 使样品呈现颜色 在电场中可预知速率（向