基因工程DNA的凝胶电泳.pptVIP

第一章 基因操作的主要技术原理 第二节 凝胶电泳 凝胶包含复杂的孔道网络，DNA分子必须通过这些孔道才能够到达阳极。 小的DNA分子，在凝胶中迁移的更快。 凝胶的成分和浓度决定能够分离的DNA大小 琼脂糖凝胶： 相对大的孔道，分离大一些的分子； 聚丙烯酰胺凝胶： 很小的孔道，分离小的DNA分子， 能够分离仅仅相差一个核苷酸的DNA分子。 ?用途 琼脂糖凝胶： 用于DNA和RNA的常规分析 聚丙烯酰胺凝胶： 常用于小分子核酸和蛋白质分析 凝胶电泳的一般程序 制胶，点样，电泳，染色，观察 使凝胶中的DNA分子可视化 染色是最简单的方法。 溴乙锭(EtBr) 能够用来对琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA进行染色。 只要在足够的DNA存在条件下，经过EtBr染色后，在紫外照射下能以不同的条带显示出来。 注意： 溴乙锭是非常强的致癌物；紫外光也会灼伤。 因此，用于把DNA染成蓝色或绿色，又不需要紫外照射就能看见DNA的非致癌染料，越来越多地被用于实验室研究中。 染色和观察： 溴化乙锭（EB）染色， 在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪） 能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比 DNA分子大小的估计 如何确定凝胶电泳中片段的大小? 最准确的方法：利用迁移速度和分子重量间的数学关系。相关公式是： D=a-b (logM) D是迁移的距离，M是相对分子质量，a和b是依赖于电泳条件的常数。 通常使用：一种简单，但相对不太精确的估计DNA片段大小的方法。 方法：利用已知大小的DNA片段作标准(marker /ladder),目的DNA片段与之比对、估计。 例如：HindⅢ将λDNA切成8个片段，这些片段的大小都已经知道，范围从125bp到23kb。实验中的片段大小可以通过对比两条泳道中条带的位置而加以估计。 尽管不十分精确，这种方法进行起来只有5％的错误率 对放射性标记的DNA进行放射性自显影 染色的一个缺陷是其灵敏性的限制，如果每条带中DNA的含量少于10ng，则很有可能在染色后仍然看不到条带。对于微量的DNA就需要更加灵敏的检测手段。 放射自显影是一个很好的方法。 电泳前将DNA结合上放射性标记，利用X射线敏感摄影对凝胶进行拍摄就能够肉眼观察到DNA分子。 放射性DNA使胶片曝光，显示出DNA条带。 链分离凝胶-SSCP 用于单链分离,可以进行SNP的检测。 PAGE 原理： SNP: DNA长度相同，仅一个碱基不同； 加热后解链后电泳，迁移速度不同。 4 通过凝胶电泳分离染色体 传统凝胶电泳中，电场是沿着凝胶长度走向定位的，DNA分子是沿着直线向正极迁移。不同大小的DNA分子在凝胶网状孔道中迁移的时候，迁移速率不同，从而被分离开。 只有一定大小范围内的分子能够通过这种方法分离，因为对于大分子来说，分子越大，迁移速率的差异越小。 实际操作中，普通的凝胶电泳不能有效地分离大于50kb的DNA分子。 可以分离几千kb的DNA分子。这个长度范围包含许多真核生物染色体分子，包括酵母、许多重要的丝状真菌和原生动物，如疟疾新生虫。因此，能够得到这些生物体染色体的凝胶图谱。 2. 羟甲基汞法 原理：羟甲基汞可与RNA分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。 步骤：RNA+10mM羟甲基醛，点样在含4mM羟甲基醛的琼脂糖凝胶上，电泳，染色观察 6 蛋白质电泳 方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为SDS。差别：有无变性剂 用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色变化） SDS可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。mRNA翻译产物，基因表达产物测定等。 3) 透析袋法—切下含DNA带琼脂块，放入透析袋，封口，放入电泳槽，电泳2-3小时至全部DNA离开凝胶块，反向电泳1分钟，取出DNA液，纯化、沉淀。 4) 冻融法 Agarose gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶： 丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺（29：1） TEMED 过硫酸铵（10％） 缓冲液：TBE 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 可以分离1bp的差异 用途：测序、AFLP、 为避免局部区域产生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等） 核酸测序凝胶 1984年，D.R.Cantor发明的，分离超大分子量的DNA分子。 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都