杧果炭疽病菌漆酶基因lac1克隆与序列特征分析.docVIP

杧果炭疽病菌漆酶基因lac1克隆与序列特征分析 　　摘 要：【目的】为了探明胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）漆酶基因（lac1）的序列特征，进一步研究胶孢炭疽菌的分子致病机制，【方法】以杧果炭疽病菌为材料，采用同源克隆、SEFA-PCR和RT-PCR技术对lac1基因进行扩增、并对所获得的lacl基因进行了序列特征和预测蛋白保守结构域的分析。【结果】结果表明，该基因DNA和cDNA全长分别为2 996 bp、1 773 bp，编码区含3个内含子（大小分别为47 bp、50 bp和59 bp），推测编码590个氨基酸，其分子质量约为1174.50 kDa，等电点PI为5.36。系统进化树结果显示该基因编码的氨基酸序列与多种真菌的含铜氧化物酶聚为一类，其中与C. lagenarium laccase （BAB32575.1）的同源性最高，达73%。【结论】lac1基因具备真菌漆酶基因家族的序列特征，推测lac1基因可能参与调控C. gloeosporioides菌丝生长、色素生成和致病性等。 　　关键词： 杧果； 胶孢炭疽???； 漆酶；克隆； 序列分析 　　中图分类号：S667.7 文献标志码：A 文章编号：1009-9980 　　漆酶（p-diphenol oxidase， Laccase）是一种含铜的多酚氧化酶，属多铜氧化酶（multicopper oxidase）家族，广泛存在于担子菌、半知菌和子囊菌中以及一些昆虫、细菌及黄蜂的毒液中[1]。漆酶活性与真菌孢子的萌发、色素生成、木质素降解利用有关，同时漆酶还可以保护病原真菌免受寄主植保素和鞣质等化合物的影响，在真菌对环境的适应和定殖过程中起着重要作用[2-3]。 　　杧果是世界第二大热带水果，其收获面积及产量仅次于香蕉。由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）引起的杧果炭疽病是世界杧果产区的重要病害，在果园常引起植株梢枯、叶枯及落花落果，在贮运期病果率为30%～50%、甚至100%，严重影响杧果的产量和品质，是限制杧果产业发展的主要因素之一[4]。随着分子生物学技术的发展，已经鉴定并克隆了该病原菌一些致病相关基因[5]，但未见关于漆酶基因方面的研究。本研究的目的是用同源克隆等方法，从C. gloeosporioides中克隆漆酶基因，并通过生物信息学分析预测其功能，为下一步研究其在C. gloeosporioides致病过程中的作用打下基础，以便我们更好地了解C. gloeosporioides与杧果之间的互作机制，最终为杧果炭疽病防治提供新的作用靶标。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　杧果炭疽病病菌胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides Penz.）单孢菌株A2，由中国热带农业科学院环植所热带果树病害课题组鉴定、提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 杧果炭疽病病菌菌丝的收集与核酸的提取 　　收集用PDA培养4～5 d的菌丝。DNA的提取按照BioMiga Fungal gDNA Kit说明书操作。RNA的提取按照参照AxyPrepTM Multisource Total RNA Miniprep Kit操作。 　　1.2.2 从基因组扩增lac1基因片段 参照文献[6]，设计lac1基因上下游引物：lac-F（5′-GGA ATTCTGGTAYCACAGCCACTT-3′）和lac-R（5′-GGAATT CTCRTGGCCRTGAAGRTG-3′）。以C. gloeosporioides基因组DNA为模板，扩增体系（50 μL）： 10×PCR Buffer 5 μL；dNTP Mixture（各2.5 mmol·L-1）4 μL；lac-F （10 μmol·L-1）和lac-R （10 μmol·L-1）各1 μL；TaKaRa Taq 0.5 μL；DNA模板1 μL；加ddH2O补至50 μL。扩增程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃，8 min。PCR产物的凝胶回收、连接分别按照TIANGEN和TaKaRa相应试剂盒说明书操作。 　　1.2.3 SEFA-PCR 获得lac1基因全长 参照文献[7]快速染色体步移法（Self-Formed Adaptor PCR， SEFA-PCR）引物设计原理，根据已获的lac1基因片段序列设计扩增5′端和3′端的引物。扩增5′端引物：5A2L1 （5′-CCACAGCATTGACGCCCTTTCCG-3′）； 5A2L2（5′-AGTCGCTGATGGCATAAGGACCGAG-3′）；5Hemin-A2L3