山东常用垫料发酵菌制剂中有效菌分析鉴定.docVIP

山东常用垫料发酵菌制剂中有效菌分析鉴定 　　摘 要： 　　选择山东省内应用范围广、宣传力度大的不同剂型垫料发酵菌剂，采用微生物培养结合分子生物学的方法分离和鉴定其中的好氧发酵菌，并对其进化关系做了初步分析。结果显示：不同来源的发酵菌剂中主要有效菌均为芽孢杆菌属，菌种数量在108个/g以上，其有效菌间遗传进化关系很近，同源性都在99%以上；红糖水培养对发酵菌剂E、F的增殖效果不稳定，培养液中含菌量都不到108个/g，粉剂型含菌量高且稳定、更经济实用。 　　关键词：山东省；垫料；发酵菌剂；有效菌；分析鉴定 　　中图分类号：TQ920.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）09-0075-04 　　菌种是制作发酵床成功的关键因素。目前，山东省内用于垫料发酵的菌制剂来源复杂，剂型多样。从剂型看，有袋装粉剂、瓶装水剂、瓶装冻干粉等。其中，袋装粉剂和水剂可直接拌入垫料中使用，而瓶装冻干粉剂则需要用红糖水增殖后使用。从发酵菌剂来源看，山东省应用较多的商品菌剂包括源自日本的洛东酵素、山东省本地企业生产的发酵床专用菌以及广西、河南等地的一些发酵床专用菌。有的发酵菌剂为单一的芽孢杆菌，直接作为垫料接种菌，而大部分菌剂为复合型菌种，标称的主要成分包括乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌、光合菌、丝状真菌、放线菌等有益微生物菌群及其代谢产物（消化酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、氨基酸、维生素等）。不同研究都报道了某一菌种发酵速度快、效果好[1～3]，还有研究显示了复合菌种的效果要优于单一菌种[4]。然而，垫料的成分和高温发酵过程并不适合复合菌剂中部分菌种的代谢繁殖。 　　为研究垫料发酵菌剂中的菌种种类、数量和在垫料发酵过程中的作用，笔者分别选择山东省内应用范围广、宣传力度大的不同剂型的垫料发酵菌制剂，采用微生物培养结合分子生物学的方法，分离和鉴定其中的好氧发酵菌，并对其进化关系做了初步分析。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　山东不同公司的发酵菌剂A、发酵菌剂B、发酵菌剂C，国外进口的发酵菌剂D，河南不同公司的发酵菌剂E及其红糖水稀释液E0、发酵菌剂F及其红糖水稀释液F0。 　　1.2 试验仪器 　　试管，培养皿，1 000、200 μl移液枪及枪头，立式高压灭菌锅LS-B50L，恒温培养箱SLI-700，超净工作台SW-CJ-1F，酒精灯，试管架，电子天平，1 L三角瓶，药匙。 　　1.3 试验方法 　　制备酵母膏蛋白胨（LB）培养基[5]、PDA培养基[6]、高氏1号培养基[5]、亚硝化细菌培养基[7]、光合细菌液体培养基[8]和溴甲酚绿指示剂培养基[9]，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。 每种发酵菌剂称取0.5 g样品于100 ml生理盐水中，摇动10 min后，进行梯度稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8各200 μl分别涂布于待用的培养皿中，每个梯度重复3次，30℃恒温箱培养，每24 h观察1次菌落生长状况并采用科学计数法作记录。 　　待培养基上出现微生物菌落并统计完数据后，挑取不同形态的数个菌落分别在液体培养基中进行纯培养，待培养1天后，菌液浑浊，单菌长成。此时，用细菌抽提DNA试剂盒对单菌菌液提取纯菌DNA，随后以其DNA为模板、F24和R1492为引物进行PCR扩增，扩增后的PCR产物片段长度在1 500 bp，送济南力戈有限公司测序，最后将测序结果提交到NCBI网站（http：//www.ncbi. /）上的GenBank数据库登记，用Blast软件检索数据库并进行相似性比较，获得同源性较高的相关菌株的16S rDNA基因序列，明确具体菌种情况并做DNAstar相似性比较和遗传进化树分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 发酵菌剂在培养基上的菌落生长状况 　　试验结果表明，所有试验发酵菌剂在LB培养基上生长最为旺盛，在亚硝化细菌培养基和光合细菌培养基上不生长；发酵菌剂C在6种培养基上均无菌落生长；发酵菌剂D除在LB培养基上生长较好外，在其它培养基上均未见菌落生长；在高氏1号培养基上培养5 d后发酵菌剂A、B、E、F出现较多菌落。从剂型上分析，粉剂型培养得到活菌数量较水剂型更大些，在108个/g以上，发酵菌剂E0培养菌的数量明显低于其他菌剂。从活菌数量上，在考虑到试验操作过程中因缺氧死亡的数量，发酵菌剂A、B、D、E、F培养的活菌量基本能达到标定的数量（109个/g），可以在发酵垫料使用中达到较好的效果（表1）。 　　2.2 不同发酵菌剂间优势菌分析鉴定 　　选取从土壤样品中提取的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌为标准菌，对发酵菌剂间优势菌序列相似性比较及遗传进化关系进行分析，结果（图1、图2）显示：发酵菌剂D在遗传进化上与枯草芽孢杆菌最近；发酵菌