利用凝集素修饰二氧化硅玻璃球去除胶原蛋白中内毒素.docVIP

利用凝集素修饰二氧化硅玻璃球去除胶原蛋白中内毒素 　　摘要[HTSS]利用凝集素分子对醣类有专一性吸附特性，对内毒素结构中的多醣类成分进行吸附，建立了凝集素去除胶原蛋白溶液中内毒素的吸附系统。二氧化硅玻璃经酸蚀，再以胺基硅烷进行胺化后，将凝集素嫁接其上。结果表明，1， 2和5 g/L的凝集素对于胶原蛋白溶液中内毒素吸附率皆大于99%；30颗嫁接凝集素玻璃球可去除8.4 mL胶原蛋白溶液（浓度为2 g/L）中内毒素（去除率大于99%）。未来更可将嫁接凝集素玻璃球填充于管柱内部，利用管柱分离法去除胶原蛋白溶液中内毒素，建立有效、操作简单且成本低廉去胶原蛋白溶液内毒素装置。 　　1引言 　　随着组织工程技术的迅速发展，许多组织修复生物性取代材料纷纷问世，并已成功应用于皮肤、外围神经、牙周组织及齿槽骨等组织再生领域。其中，胶原蛋白是众多取代材料中应用最为广泛，且最具潜力的生物材料。胶原蛋白应用范围涵盖保健营养品、化妆品和高阶医药等众多产业，利用其生物兼容性、具生物可降解性、抗菌性与止血性等优点，经适当后续处理后，可控制其在体内分解速率并可加工成不同的应用型态[1]。 此外，胶原蛋白还可依据临床应用的需求，制成薄膜、海绵状、粉末或纤维织品等多种形态， 作为止血、整型外科及烧烫伤敷料等临床应用。然而，市面上贩卖的胶原蛋白多受到内毒素存在的困扰，许多以胶原蛋白为原料的医用产品，常会因为其内毒素含量过高，造成材料与生物体接触或植入后产生严重免疫反应而限制其应用。因此，寻求有效去除内毒素方法，对于发展胶原蛋白材料在医用产品方面的应用极其重要。 　　内毒素为革兰氏阴性菌细胞壁外膜的一部份，革兰氏阴性菌的细胞膜内层为磷酯层，内毒素则是存在于外膜。内毒素为具有疏水性脂多醣体（Lipopolysaccharide，LPS）的小分子，分子量约为10 kDa。生物体毒性反应主要来自脂质部分（Lipid A）。当内毒素（脂多醣体分子）进入动物体血液或身体组织中时，脂多醣体会启动体内的各种免疫反应，产生发烧、白血球数目改变、弥漫性血管内凝血反应、低血压、休克，甚至死亡等非特异性的生理病理反应。即使少量的??毒素也会导致大多数的哺乳动物死亡[2，3]。 　　内毒素为高度热稳定性分子，煮沸30 min仍无法破坏其稳定性，超氧化物、过氧化物和次氯酸盐（漂白水）等强氧化剂可将其分解。由于内毒素具高度热稳定性，同时亦具有良好的化学稳定性，因此须使用强氧化剂才可将其分解；然而胶原蛋白不论是在高温处理或是强氧化剂的反应后，皆会产生变性现象，因此胶原蛋白并不适用此类方法去除所含内毒素。目前，去除胶原蛋白中内毒素的方法为：在胶原蛋白萃取纯化过程中采取全程无菌操作及严密的无菌控管，以制备出无内毒素的胶原蛋白；另可在胶原蛋白萃取后以不同分子量过滤膜过滤内毒素与胶原蛋白；或以离子交换法去除胶原蛋白中的内毒素[4-6]。上述方法均能将内毒素从胶原蛋白溶液中移除，但实验成本相当高，使得低/无内毒素的胶原蛋白价格居高不下，限制胶原蛋白的发展及应用。此外，有研究利用脂多醣体分子中的Lipid A基团， 以脂质吸附进行包覆以形成微胞，进而将内毒素移除[7，8]，但此分离方法不适用于去除内毒素胶原蛋白材料的大量生产。 　　本研究利用凝集素分子对于醣类分子专一吸附特性，对内毒素结构中的多醣类成分进行吸附，以除去胶原蛋白溶液中所含内毒素。凝集素是一种对醣类具有高度特异性的醣类接合蛋白[9，10]。在免疫技术中常利用凝集素辨识细胞膜上特定醣蛋白结构。凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，因此常作为研究细胞膜上特定醣基的探针，或是应用于分离纯化具有重要生物功能的醣类。不同凝集素对特定醣基具有专一性的结合能力，如小麦凝集素对N乙酰葡萄糖胺有特异性结合能力，在内毒素脂多醣体分子中含有N乙酰葡萄胺，因此或可利用凝集素进行N乙酰葡萄胺吸附以除去内毒素。本研究最终目标是以凝集素去除胶原蛋白溶液中内毒素，并进一步将嫁接凝集素玻璃球填充于管柱内部，利用管柱分离法去除胶原蛋白溶液中内毒素，建立有效、操作简单且成本低廉去胶原蛋白溶液内毒素装置，从而大幅降低低/无内毒素胶原蛋白制造成本，提升胶原蛋白产品整体应用的成效。 　　2实验部分 　　2.1胶原蛋白萃取与纯化 　　于4 ℃，将牛皮除毛，以0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液冲洗干净，将牛皮剪成约0.5 cm×0.5 cm的碎片；以0.15 mol/L NaCl、50 mmol/L Tris缓冲液 （pH 7.4）清洗后，将其置入0.5 mol/L醋酸溶液中，以均质搅拌机打碎，使胶原蛋白从牛皮组织中溶解出来；加入0.5 g/L胃蛋白酶作用16-24 h后，高速离心溶有胶原蛋白的醋酸溶液，收集上清液；加入2.5 mo