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第3章 蛋白质的通性、纯化和表征 主要内容 蛋白质的性质 酸碱性质 蛋白质的胶体性质（蛋白质的沉淀） 蛋白质分离纯化 一般原则 分离纯化方法***** 含量测定与纯度鉴定 一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质是两性电解质。 酸碱性质主要决定于肽链上可解离的R基团。 蛋白质的等电点 电荷性质的判断 等电点时溶解度最小 蛋白质的等离子点：在无盐类干扰情况下，一种蛋白质的质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH是它的真正等电点，称为等离子点。 它是蛋白质的特征常数。 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 1. 蛋白质的胶体性质 蛋白质的分子大小属于胶体质点的范围。 蛋白质溶液是一种亲水胶体。 有水化层、双电层——胶体系统相当稳定。 具有丁达尔效应、布朗运动、不能通过半透膜。 2. 蛋白质的沉淀 盐析法： 中性盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）—水化层 不变性，除盐后可溶解。 有机溶剂沉淀法： 极性有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮）—水化层、降低介电常数 低温下快速操作可减慢变性速度。 重金属盐沉淀法： 重金属（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag2+)—与带负电荷蛋白质形成不溶性盐 误服重金属盐：服用大量的牛乳或豆浆，再服用催吐剂排出体外。 可使蛋白质变性。 生物碱试剂和某些酸类沉淀法： 生物碱：鞣酸、苦味酸、钨酸、碘化钾 酸类：三氯醋酸、磺基水杨酸、硝酸 pHpI，蛋白质带正电荷，与其生成沉淀。 加热变性沉淀法： 使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层和双电层。 三、 蛋白质分离纯化的一般原则 总目标：增加蛋白制品的纯度或比活力，以增加单位蛋白质质量中所要蛋白质的含量或生物活性（以活性蛋白/毫克蛋白表示），并希望所得蛋白质的产量达到最高值。 分离纯化蛋白质的一般程序 前处理 粗分级分离 细分级分离 结晶 四、蛋白质的分离纯化方法 透析和超过滤 盐溶和盐析 有机溶剂分级分离法 超速离心 层析（色谱） (chromatography)*** 电泳 (electrophoresis)*** 1 透析和超过滤 2 盐溶和盐析 盐溶：中性盐可增加蛋白质的溶解度。 蛋白质吸附盐离子后带电彼此排斥，且与水作用增强。 二价离子比一价离子的影响力大。 盐析：使蛋白质沉淀。 水的活度降低，自由水变成盐离子 的水化水，蛋白质的疏水表面暴露。 去盐后能再溶解。 3 有机溶剂分级分离法 甲醇、乙醇和丙酮（与水互溶）： 使蛋白质沉淀，变性。 使水溶液的介电常数降低，蛋白质的离子化程度减弱，水化程度降低；与蛋白质直接争夺水化水。 冷却到-40℃至-60℃，不断搅拌下加入。 聚乙二醇： 水溶性非离子聚合物，脱去蛋白质的水化层。 聚乙二醇与蛋白质的亲水基团发生相互作用并在空间上阻碍蛋白质与水相接近。 4 超速离心 沉降速度法 沉降系数（s）：单位离心场强度的沉降速度。 沉降速率：把蛋白质样品溶液放在离心机内的特制离心池中，在离心场的作用下，蛋白质分子将沿旋转中心向外周方向（径向）移动，并产生沉降界面，界面的移动速度代表蛋白质的沉降速率。 一种蛋白质分子在单位离心力场里的沉降速度为恒定值。 沉降系数单位（S）： 10-13秒作为一个单位。 S常用来近似地描述生物大分子的大小。 蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于1× 10-13到200 × 10-13秒的范围。 5.1 基本原理 两相：固定相（静相）和流动相（动相） 有效分配系数： 5.2 层析的分类 按流动相：气相、液相色谱等； 按操作形式不同：纸层析、薄层层析、柱层析等； 按分离机制：凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、吸附层析等。 5.2.1 纸层析（Filter-paper chromatography） 5.2.2 薄层层析（Thin-layer chromatography） 根据蛋白质分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法。 介质：凝胶颗粒（多孔的网状结构） 交联度或孔度（网孔大小）——凝胶的分级分离范围 交联葡聚糖——Sephadex G-50（1500-30000） 琼脂糖 ——Sepharose或Bio-Gel A 聚丙烯酰胺——Bio-Gel P ② 离子交换层析（Ion-exchange chromatography） 根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。 介质：离子交换树脂 溶液中的离子与树脂上的带电基团进行交换反应； 各种离子交换能力不同，与树脂结合