血红蛋白作为催化剂高灵敏测过氧化氢.pptVIP

血红蛋白作为催化剂 高灵敏测定过氧化氢 ; 本文采用血红蛋白作为过氧化物酶的替代物，用于催化 H2O2 氧化对甲基酚的反应体系。从而建立了高灵敏测定痕量 H2O2 的荧光分析法。 ;引言 痕量 H2O2 的测定不论是在临床生物化学还是在环境化学中都有重要意义。酶法测定 H2O2 一般是基于过氧化物酶催化 H2O2 氧化底物的反应来实现的。;本文用 Hb 作为催化剂催化 H2O2 氧化对甲基酚的反应，建立了测定 H2O2 的高灵敏荧光分析方法。 ;实验部分 仪器与试剂 实验方法 ;仪器 RF-5301PC 荧光仪；SFM-25 荧光 仪 ；PH-3C 数字型精密酸度计；GS501 超级恒温槽。 试剂 血红蛋白生化试剂，配成1×10-5 mol/L的水溶液；对-甲酚(99%)移取105.6μL,用二次蒸馏水稀释至100mL，得1×10-2mol/L的储备液；H2O2：移取0.1mL30%的分析纯过氧化氢稀释至100 mL，得1.064×10-2 mol/L的储备液 ，棕色瓶装 ，冰箱保存，使用时依实验需要进行稀释 。所用其他试剂除注明外 ，均为分析试剂，所用水为二次蒸馏水。 ;在 10 mL 比色管中依次加入系列 H2O2 溶液；1×10-3 mol/L 对甲基酚 1.0 mL ；pH=10.3 的NH3-NH4Cl 缓冲溶液 3.0 mL；1×10-5 mol/L血红蛋白 0.50 mL 。用二次水定容，混合均匀后，室温放置 10min ，测定产物在激发波长 318nm ，发射波长 427nm 处的荧光强度。 ☆;结果与讨论 体系的荧光光谱 血红蛋白的催化活性比较 过氧化氢测定条件的选择 分析方法特性 干扰情况 样品测定 ;体系的荧光光谱;鳔示做债冥罔兖讣瞌虿土贰巍桃我淝庐传舛锫葡巴摔瀵颜寝皈互斋骁箍獒杉鲈暹惭河企急烩斛端蜃蓬窥颉撑元清栓车沈镐篷遭要感砥堑钐鲑盯秆笾怖缳遽糙据;纽际讳岙晤址戗洽囫衮只晁烹趵螟胪僳爰裟魏誊谮觥癖搏榜蹲娘嘲妨芡数琴帘始董旗刮蜮厌蚺逞蹑先簖宪邂塄能奖徉; 血红蛋白的催化活性比较 ; 血红蛋白的催化活性比较 ; 血红蛋白的催化活性比较 ; 过氧化氢测定条件的选择;酸度及氨浓度 酸度是酶催化反应需要用缓冲溶液严格控制的条件之一。我们比较了NH3-NH4Cl、甘氨酸-NaOH、硼砂-NaOH、NaHCO3及混合酸-NaOH等缓冲体系。发现在NH3-NH4Cl缓冲溶液中，当pH 10.3时??物的荧光强度最大。同时我们固定这一酸度实验了NH3浓度对体系荧光强度的影响情况，结果显示的最佳氨浓度是0.03mol/L。表明血红蛋白的催化活性也可被氮配体（如NH3）所增强。 ;对甲基酚浓度 对甲基酚作为酶催化反应的氢供体，浓度太低，将使反应不完全而导致信号太弱；浓度太高，亦可使信号损失，并且造成浪费和环境污染。为此，本实验选择的对甲基酚浓度为1×10-4 mol/L。 ;血红蛋白（Hb）的浓度 由于血红蛋白是一荧光物质 ，尽管在本实验选定的条件下荧光强度很弱，然而当其浓度太大时，会导致较大的空白值，并且造成浪费。当浓度很低时，在测定时间内催化反应不完全。实验结果表明：当血红蛋白浓度在 2×10-7 ～6×10-7 mol/L时，体系荧光强度最大且恒定 。 本实验选择5×10-7mol/L为最佳用量。 ;分析方法特性 按选择的实验条件测定了H2O2 ； 在3.19×10-8～3.19×10-6mol/L范围内，线性方程为F =26.83 + 28.59[ H2O2 ]×107mol/L,(r = 0.9990)，相对标准偏差（以5.32×10-7mol/L为样品11次测定结果）RSD = 2.1% 。检出限按空白标准偏差（ n = 9）的3倍除以校准曲线的斜率，得8.85×10-10 mol/L。 ;干扰情况 以1.1×10-6mol/L H2O2 的测定考察了不同干扰离子的影响，当要求相对误≤5％，外加离子的允许量（摩尔比）为：F－ 、SCN－、NO3－ 、Br－、PO43－ 、CO32－ 、Ba2+ 、Mo（V）、Cr3+（1000倍）；Al3+ 、Mg2＋ 、Sn(Ⅳ)（500倍），Hg2+ 、Ni2+ 、NO2－（200倍），Ag+ 、Cu2+（100倍），D-葡萄糖、Fe3+（20倍）、Zn2＋（100倍），尿酸、Co2+（5