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土壤拮抗放线菌分离与筛选效果研究 　　摘要 针对青海地区不同类型的土壤进行放线菌的分离、筛选。结果表明，10-3倍土壤稀释浓度为分离放线菌的最佳土壤稀释浓度；重铬酸钾是一种高效、方便、廉价的杂菌抑制剂，共筛得102株形态各异的放线菌，有32株菌分别对9种指示菌有较强的拮抗性，26株对不同细菌有较强抑菌活性，6株对真菌有抑菌活性，其中第24号放线菌对不同的指示菌的拮抗性最好。 　　关键词 放线菌；分离；拮抗性；筛选 　　中图分类号 Q939.13+2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）17-0225-02 　　农用抗生素作为生物农药，以其高效、低毒、无残留等优点在农作物病虫害防治中发挥着重要作用[1-2]。放线菌是具有巨大实用价值的一类微生物，目前从微生物中发现的大约8 000种生物活性物质中，近70% 是由放线菌产生的[3]。自然界中，尤其是土壤中，放线菌资源异常丰富。据统计分析，1 g土壤中通常含有1 000万个放线菌，因此开发土壤中的放线菌一直是研究的热点，目前已取得很大的成就。该试验从青海省采集的土壤中分离、筛选出1株具较强抑菌活性的放线菌N24，为拮抗放线菌资源在无公害生物农药的研发与应用提供了一些基础数据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　1.1.1 供试待分离土样。曲阜师范大学实验室于2012年8月在青海省不同地区、不同生态环境中的枸杞植被根部的挑选采集了4份土壤样品材料，并把每个标准地土壤剖面的同一层次的土样混合后立即转入无菌的塑料袋中带回实验室。 　　1.1.2 供试菌株。金黄色葡萄球菌、产气杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、青霉、黑曲霉、木霉、根霉均由曲阜师范大学实验室保存。 　　1.1.3 供试培养基及试剂。高氏一号培养基：用于菌株分离、培养性状观察及保藏。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基于120 ℃高压灭菌30 min，放置备用，用于拮抗性测定和培养性状观察。LB培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0，琼脂1.5%[4-5]。 　　1.1.4 仪器及设备。主要有w202B升降恒温水浴锅、高压灭菌锅、SW-CJ-2FD洁净工作台、血球计数板、pH试纸、打孔器等。 　　1.2 试验方法 　　采集土样→预处理??放线菌的分离→菌株纯化→琼脂块法初筛→杯碟法复筛→选取抑菌性菌株。 　　1.2.1 土壤样品预处理。取土壤表层以下5～10 cm处的土样。进行预处理，自然条件下风干7 d，再用3种不同的物理、化学等方法对样品进行预处理。 　　1.2.2 制备土壤稀释液（无菌操作）。一是称取土样5 g，迅速倒入带玻璃珠的无菌水瓶中（玻璃珠大约30粒），振荡30 min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。二是用移液枪吸取10-2的土壤悬液0.5 mL，放入4.5 mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可制成10-4的稀释液（每个稀释度换用1个枪头，每次吸入土液后，要将枪头插入液面，吹吸3次）。 　　1.2.3 放线菌的分离。 　　（1）涂布。每份土样各取10-2、10-3、10-4稀释液100 mL，用移液枪严格按照无菌操作要求，加入对应编号培养皿中，然后用无菌的涂布棒在平板上将悬浮液轻轻涂布均匀[6]。 　　（2）平板划线分离微生物。使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，目的是获得单个菌落。 　　（3）纯化。从培养后的第3天起，根据菌落形态、气生菌丝特点等挑选放线菌单菌落，将生长成熟的菌落及时用无菌接种针挑取到高氏一号培养基斜面，培养7～14 d后检查。同一土壤样品在不同培养基上分离到的不同放线菌菌株统一编号后，在4 ℃冰箱暂时斜面保存。 　　1.2.4 抑菌活性测定。每种拮抗菌都有自己的抗菌谱。抗菌谱的测定可以为拮抗菌的使用范围提供试验依据。选用金黄色葡萄球菌、产气杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、青霉、黑曲霉、木霉、根霉9种菌作为检定菌，采用传统的琼脂块法进行初筛，以杯碟法进行复筛，来筛选对金黄色葡萄球菌等9种指示菌具拮抗活性的放线菌，记录其编号，并分别转接到相应分离培养基斜面上保存[7]。 　　（1）拮抗放线菌的初筛。将保存的放线菌菌株活化后，采用琼脂块法[8]进行筛选：将供试放线菌涂布接种在高氏一号培养基平板上，置于28 ℃培养8 d，用打孔器（直径=8 mm）将其切成菌块，将供试病原菌用无菌水配制成菌悬液（6×108～9×108 cfu/mL），取100 μL分别涂布在PDA与LB培养基上，制成含菌平板，每个处理重复3皿。以不加放线菌菌饼作为对照，细菌置37 ℃培养箱培养1 d后测量抑菌圈的直径，真菌置