菇类检验方法－橘黄裸伞之检验.DOC

菇類檢驗方法－橘黃裸傘之檢驗 1. 適用範圍：本檢驗方法適用於橘黃裸傘之檢驗。 2. 檢驗方法：聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）方法及即時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）方法。 2.1. 工作環境：工作平台需寬敞、潔淨、光線良好。檢體前處理、檢體DNA抽取、PCR試劑配製及PCR等實驗過程皆需有區隔空間，避免交叉污染。PCR試劑之配製應於無菌操作台內進行。 2.2. 裝置（註1） 2.2.1. 分光光度計：具波長260 nm、280 nm。 2.2.2. 旋渦混合器（Vortex mixer）。 2.2.3. 真空乾燥裝置：供DNA乾燥用。 2.2.4. 真空冷凍乾燥裝置：溫度可達-40℃以下，真空度可達133 mBar以下，供檢體乾燥用。 2.2.5. 加熱振盪器：具65℃溫控及振盪功能。 2.2.6. 微量冷凍離心機：可達20000 × g，並具4℃溫控功能。 2.2.7. 離心機：供各式微量離心管離心用。 2.2.8. 聚合酶鏈反應器：ABI PRISM 9700 Sequence Detector，或同級品。 2.2.9. 即時聚合酶鏈反應器（註2）：ABI PRISM 7700 Sequence Detector或Roche LightCycler，或同級品。 2.2.10. 電泳槽：供DNA電泳用。 2.2.11. 振盪型粉碎機：Retsch MM200，或同級品。 2.2.12. 照相裝置：供拍攝電泳膠片用。 2.2.13. 紫外燈箱：具波長312 nm、365 nm紫外燈。 2.2.14. 冷凍設備：具冷藏及凍結功能。 2.2.15. 高壓滅菌釜。 2.2.16. pH測定儀。 2.2.17. 水浴裝置：溫差 ±1℃以內者。 2.2.18. 天平：最大稱重量為2000 g，靈敏度為0.1 g；最大稱重量為100 g，靈敏度為1 mg。 2.2.19. 無菌操作台。 ? 註1： 本方法所使用或提及之產品品牌不代表為同類產品中最好者；反之，未使用或提及之產品品牌亦不代表為同類產品中較差者。 註2：確認試驗用。 ? 2.3. 試藥 2.3.1. DNA抽取用：RNase A、乙醇（96-100%）均採分子生物分析級試藥；DNeasy? Plant Mini套組及內附試劑（RNase A、AP1、AP2、AP3/E、AW與AE）、離心管柱（DNeasy spin column）與收集管。亦可採用其他市售套組。 2.3.2. PCR用（註3） 2.3.2.1. 鑑別試驗用引子 2.3.2.1.1. 共通性基因（標的基因：ribosomal RNA，供作內部對照基因） 引子F：18S-F, 5-GTCCCTGCCCTTTGTACA-3 引子R：26S-R, 5-CGCCGTTACTAGGGGAATCCT-3 PCR增幅產物大小600～800 bp 2.3.2.1.2. 橘黃裸傘（標的基因：internal transcribed spacer，ITS） 引子F：GY-F, 5-TTCTAATGGTCTGGATTGGGGGTC-3 引子R：GY-R, 5-CGCATCCCATTTAAAGCAGACAT-3 PCR增幅產物大小131 bp 2.3.2.2. 確認試驗用引子及探針 橘黃裸傘（標的基因：internal transcribed spacer，ITS） 引子F：GY-F, 5-TTCTAATGGTCTGGATTGGGGGTC-3 引子R：GY-R, 5-CGCATCCCATTTAAAGCAGACAT-3 探針P： GY-P, 5-(FAM)-ACCGGCTAATACATTTAAGGGGAGCGAT-(TAMRA)-3 PCR增幅產物大小131 bp ? 註3：合成之引子及探針，拆封後，以無菌純水稀釋成適當濃度，分裝後置於-20℃貯存備用，另探針需避光保存。探針5端採用6-carboxy-fluorescein（FAM）標記，3端採用6-carboxytetramethyl-rhodamine（TAMRA）標記。 ? 2.3.2.3. 去氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP） 含去氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate，dATP），去氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate，dCTP），去氧鳥糞嘌呤苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate，dGTP）及去氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate，dTTP）各2.5 mM之溶液。 2.3.2.4