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桃果实PpCuZnSOD基因原核表达、纯化与鉴定 　　摘 要： 【目的】为了实现桃铜锌超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的高效表达，获得表达稳定、蛋白纯度高、活性强的工程菌，【方法】将前期获得的PpCuZnSOD基因（GenBank登录号：JX217743）重组到原核表达载体pET-32a（+）中，并转化到Escherichia coli BL21（DE3）宿主菌，经IPTG 进行诱导表达。对表达产物进行SDS和Western blotting 检测，镍柱亲和层析纯化，并采用Brad Ford 方法测定融合蛋白浓度，黄嘌呤氧化法分析其酶活。【结果】成功的构建了原核表达载体pET-32a（+）-PpCuZnSOD，并获得分子质量约为35 kDa的诱导表达产物，纯化后融合蛋白浓度为183.7 mg·L-1，活性为5.23×103 U·mg-1。 【结论】成功构建了桃pET-32a（+）-PpCuZnSOD原核表达载体，表达量高、稳定性强，重组表达产物具有较高CuZnSOD酶活性，为桃CuZnSOD酶的进一步研究奠定了基础。 　　关键词： 桃； PpCuZnSOD； 原核表达； 纯化； 鉴定 　　中图分类号：S662.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪02-0185-06 　　超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）在植物中普遍存在， 具有清除自由基、维持活性氧代谢平衡、保护膜结构的功能、延缓器官衰老过程的作用[1]。根据酶活性中心的辅基部位结合的金属离子的不同，SOD可分为3 种类型：CuZnSOD、MnSOD和FeSOD[2]，其中CuZnSOD是3种歧化酶中含量最丰富的一种，是活性氧清除酶系统中最重要的酶，具有减轻膜脂过氧化的作用。大量研究发现，提高植物体内抗氧化酶活性和增强抗氧化代谢的水平是提高植物抗逆性的有效途径[3-6]。SOD的研究受到国内外学者的广泛关注[7]。前人对草莓[8]、番荔枝[9]、桃[10]等果实成熟软化的研究表明，SOD酶活性与果实硬度密切相关；此外SOD在医疗保健方面和食品加工等方面也具有重要作用，CuZnSOD 是一种疗效广泛的药用酶，在适当的条件下，补充外源SOD能调节机体的代谢、提高人体的免疫功能，能够有效的防治某些疾病和延缓衰老，SOD作为保鲜剂、抗氧化剂以及功能食品的营养强化剂在食品加工方面也有着广阔的应用前景[11-12]。 　　近年来， 对几种主要模式生物SOD基因的克隆、功能分析以及蛋白质表达已进行了深入的研究[13]，在陆地棉[14]、野桑蚕[15]、杨梅[16]和珍珠粟[17]等植物中发现的CuZnSOD也实现了体外表达。笔者在桃中获得了包含完整编码区的PpCuZnSOD基因（GenBank登录号：JX217743），在此基础上，成功构建了该基因的原核表达载体pET-32a（+）-PpCuZnSOD， 并在大肠杆菌中得到高效表达，层析纯化后获得具有高活性的CuZnSOD酶，对进一步研究PpCuZnSOD基因的作用功能奠定了基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 试验材料与试剂 　　大肠杆菌 DH5α用于基因克隆，BL21（DE3）作为融合蛋白表达的宿主，2种大肠杆菌均为实验室保存。pGEM-PpCuZnSOD 重组质粒，PCR产物克隆的载体pGEM-T vector和DNA回收试剂盒购自TIANGEN公司，PCR Kit购自Ferments公司，TaKaRa公司的MiniBEST Plasmid KIT Purification质粒提取试剂盒，表达载体 pET-32a（+）购自Novagen，限制性内切酶BamH I和Xho I以及 T4 DNAligase均购自Fermentas；SOD 试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Ni-NTA SefinoseTM Kit，DAB显色试剂盒购自生工生物；一抗、二抗购自北京博奥森公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 融合蛋白原核表达载体的构建 1）PpCuZnSOD基因CDS引物设计与PCR扩增。以克隆得到的PpCuZnSOD基因序列为模板设计桃PpCuZnSOD基因CDS的PCR引物，设计如下包含BamH I和Xho I识别位点的引物。PpCuZnSOD-F：5-CGCGGATCCATGGTGAAGGGCGTTGCTGTT-3，CGCGGATCC为接头序列，其中CGCG为保护碱基，GGATCC为BamH I识别位点，并包含了PpCuZnSOD的CDS的起始密码子ATG；PpCuZnSOD-R：5-CCGCTCGAGTCAGTTTTGGAGACCAATAAT-3。CCGCTCGAG为接头序列，其中 CCGC为保护碱基，CTCGAG为Xho I的识别位点，TCA为终止密