基于免培养技术食用菌病害微生物rDNA测序及初步分析.docVIP

基于免培养技术食用菌病害微生物rDNA测序及初步分析 　　作者简介：高 能（1986-），女，硕士研究生，主要从事食用菌栽培、遗传育种及食用菌病害研究。 　　通讯作者，E-mail：sdgzy2656@126com 　　摘要：采用CTAB结合DNA凝胶回收试剂盒法提取四种主要食用菌病害组织样品的宏基因组DNA，用16S rDNA和18S rDNA通用引物分别对样品的基因组DNA进行PCR扩增、连接、转化并进行单克隆测序。每对引物随机挑取20个阳性克隆的rDNA序列进行比对，并对病害微生物的亲缘关系进行了初步分析，结果表明四种病害样品中两种为细菌性病害，两种为真菌性病害。 　　关键词：免培养；食用菌病害；rDNA 序列分析 　　中图分类号：Q789 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）06-0011-05 　　食用菌病害研究的传统检测方法主要包括分离、纯化、显微观察、染色技术、生理生化测定等[1]，所需时间长，准确性较低，往往需要结合其他鉴定技术（如PCR等分子技术）来提高其准确性。 　　自Pace等[2]首次提出环境宏基因组学、Handelsman等[3]提出基因组的定义以来，宏基因组学已作为新的分子生物学方法，成功应用于土壤[4]、海洋[5]环境微生物及消化道等菌群[6，7]的多样性研究中。宏基因组技术是以样品中的微生物群体总基因组作为研究对象，利用测序分析等生物信息学方法，基于非培养方式进行微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系等的研究。本试验基于免培养技术直接提取病害样品的宏基因组DNA，以16S rDNA/18S rDNA为靶基因进行病害微生物鉴定及亲缘关系初步分析，为食用菌病害的分子检测方法研究提供了依据。 　　1 材料与方法 　　11 试验材料 　　111 材料 样品1为平菇黄腐病病样（PG，图1A），采自济南平阴县孔村镇食用菌基地；样品2为双孢菇褐斑病病样（SBG，图1B），采自菏泽市定陶县马集乡牛杨村双孢菇种植基地；样品3为鸡腿菇黑头病病样（JTG，图1C），采自济南平阴县孔村镇食用菌基地；样品4为金针菇疑似胡桃肉状菌病病样（JZG，图1D），采自济南遥墙食用菌种植基地。 　　112 试剂 CTAB、Tris碱、EDTA、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、Taq PCR Master Mix、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒等分子试剂，均购自上海生工生物工程有限公司。 　　113 引物 细菌16S rDNA通用引物[8]：XF： 5′-AGGCCTAACACATGCAAGT-3′，XR： 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′；真菌18S rDNA通用引物[9]：ZF： 5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′，ZR： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；pUCm-T载体引物：TF： 5′-GTTGTAAAACGCAGGCCAG-3′，TR： 5′-CAGGAAACAGCTATGA-3′。引物合成及基因测序均由上海生工生物工程有限公司完成。 　　12 试验方法 　　121 总基因组DNA提取 将所采集样品的病害部位分离备用，采用CTAB结合DNA凝胶回收试剂盒法提取基因组DNA[10]。 　　122 PCR扩增及纯化 分别利用16S rDNA/18S rDNA通用引物对各个样品总基因组DNA进行PCR扩增，扩增体系按照试剂盒说明。PCR扩增条件：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，50～55 ℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸10 min。并将其产物纯化，具体步骤参照试剂盒使用说明。 　　123 连接转化 参照T-载体PCR产物克隆试剂盒方法，将纯化的PCR产物与pUCm-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α。 　　124 菌落PCR检测 利用pUCm-T载体的引物，根据单菌落PCR检测法[11]对从含有Amp的LB平板上挑取的单菌落进行PCR扩增，检测是否为阳性克隆。反应体系（25 μl）参照Taq PCR Master Mix使用说明。反应条件：96℃预变性10 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。 　　125 序列分析 每个样品每对引物随机挑选20个阳性克隆进行测序。在GenBank中进行Blast序列比对，从基因数据库中下载病原菌属中代表种的16S rDNA或18S rDNA序列，利用MEGA 505等软件对所得序列及其它常见食用菌病原微生物模式种的序列进行初步的亲缘关系分析，构建病原菌属的系统发育树（N-J树）。 　　2 结果与分析 　　21 宏基因组DNA的提取 　　由图