土壤微生物总DNA提取方法的自主实验设计报告.docVIP

土壤微生物总DNA提取方法对比研究（初稿） 实验背景：土壤中未培养的微生物约占总量的99%，可见土壤微生物资源还具有极大的开发价值，随着宏基因组学和分子生物学的快速发展，基于群体基因组学的方法研究土壤微生物多样性和挖掘生物基因资源的策略得到广泛的应用。 实验目的：提取出高质量的总DNA是研究生物基因资源的基础，本项目搜集了几种提取方法，旨在通过对比试验，确定提取土壤DNA的较优方案。 实验方法： 1. 高温裂解法 方法参阅附件文献2 2. 优化法 土壤样品: 供试的土壤样品采集于不同的地区，选择天然土样，取样深度为5 － 20 cm 左右，除去明显颗粒杂物，装入无菌袋中，－ 80℃冰箱保存。 1.称取10 g 经筛子过滤后的土壤样品加入50 mL 无菌离心管中，加入10 mL 裂解缓冲液( 100 mmol /L Tris-HCl，100 mmol /L Na EDTA，100 mmol /L 磷酸钠，1. 5 mol /L NaCl，1 %［w / v］CTAB，pH8. 0) ，振荡混匀，放置在恒温摇床( 37℃，200 r /min ) 45 min。 2.向样品中加入溶菌酶( 终浓度为10 mg /mL) ，混合均匀，37℃恒温水浴3 h，每30 min 温和颠倒混匀1次。在样品中加入SDS ( 终浓度为4% ) ，65℃ 水浴2 h，每30 min 温和颠倒混匀1 次( 可以使用玻璃棒等将沉淀的土壤搅匀) 。直接加入1 /5 体积的氯仿( 提前预冷) ，轻微振荡混匀，4℃，3500 × g 离心15 min。取上清，加入1 /3 体积的20% PEG，2. 5 mol /L NaCl来沉淀DNA。放置于4℃冰箱过夜。 3.4℃，3000 × g 离心20 min 来沉淀DNA。弃去上清，保留DNA 沉淀，用70% 冰乙醇洗涤DNA 3 － 4 次，每次静置20 － 30 min，自然风干DNA，加入200 μLTE。待DNA 样品溶解后，将DNA 粗品过PVPP 柱( 先用3 mol /L HCl 处理PVPP 过夜，再用200 mmol /L NaH2 PO4漂洗至pH 为7. 0，121℃，灭菌备用，吸取700 μL 灭菌的PVPP 悬液加入垫有少许棉絮的1 mL 无菌注射器中，短暂离心即可) ，4℃，2200 × g 离心15 min，得到的DNA 样品放在－ 20℃ 备注：还有其他多种方法，挑选了两种相对经济且便捷的方式。（方法参阅文献1） 3. 测定两种方法制备同一土壤样本的DNA OD260/280 和OD260/OD230，对比效果。 项目安排计划： 实验一：1预处理土壤样本和实验试剂配置（1d） 实验二：2两种方法提取DNA(2d) 实验三：3比较分析，可设计PCR或跑电泳观察提取DNA条带异同，分析两种方法优缺点，详细PCR方法可参看文献1中。（考虑到前面实验较繁琐）