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裂叶马兰无性系建立研究 　　摘 要： 为保护野生资源、满足栽培对种苗的需求，以裂叶马兰的嫩茎为外植体，进行愈伤组织诱导与分化、不定芽生根、试管苗生根继代增殖的研究，以及试管苗移栽和定植的研究，建立起裂叶马兰的无性系。结果表明：MS+ 蔗糖35 g·L-1 +6-BA0.5 mg·L-1+2，4-D2.5 mg·L-1是嫩茎愈伤组织诱导培养和继代增殖培养的适宜培养基；MS+蔗糖30 g·L-1+ AgN031.0 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1 +ZT1.6 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1是愈伤组织分化培养的适宜培养基；1/2MS+蔗糖20 g·L-1 + NAA 0.6 mg·L-1是不定芽生根培养和试管苗生根继代增殖培养的适宜培养基；试管苗移栽成活率为95.9%；定植成活率98.0%。定植成活的试管苗保持了野生裂叶马兰的所有植物学性状。 　　关键词：裂叶马兰；嫩茎；无性系 　　中图分类号：S334.1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.10.003 　　裂叶马兰（Kalimeris indica（L.）Sch.-Bip.）为菊科马兰属多年生草本植物[1-2]。生长于河岸、林内草地及山坡草地[3]。全草药用，具有凉血清热、利湿解毒等功效，能治出血、疟疾、黄疸、水肿淋浊、咳嗽、咽疼喉痹、乳痈痔疮、丹毒和蛇咬伤等疾病[4]。近十多年来，辽宁南部地区的养殖专业户，将裂叶马兰的干粉作为畜禽的饲料添加剂，能较明显地减少疾病发生，提高效益。正是由于裂叶马兰能防治多种人畜疾病，进入21世纪以来，辽宁南部地区的人们一直在大量的采收裂叶马兰作为中草药和家畜饲料添加剂，致使裂叶马兰的野生资源迅速减少。为保护野生资源，进行栽培，研究者对裂叶马兰进行了无性系建立的研究。此前已有马兰属植物组织培养研究的报道[5-6]，并且还有裂叶马兰芽分化培养研究的报告[7-8]，但迄今未见裂叶马兰愈伤组织无性系建立研究的报道。本研究的目的在于采用组织培养技术探索出裂叶马兰愈伤组织无性系建立的有效途径，从而为其保护和利用奠定技术基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材 料 　　6月上旬，把大连郊区柳树村山坡上生长旺盛裂叶马兰的地上部采回实验室，并冲洗干净。将叶柄、叶片剪掉，将嫩茎切成多个5 cm左右茎段后，放到磨口广口瓶中，用自来水洗涤振荡，再用0.05%安利洗涤液洗涤约10 min，用蒸馏水将材??上的安利洗涤液泡沫冲洗干净。在经过杀菌消毒处理的超净工作台上将材料用70%～75%乙醇灭菌10 s左右，立即用无菌水振荡洗涤3次，然后加入0.05%HgCl2溶液，浸泡灭菌14 min，并迅速用无菌水洗涤6次[9]，即可获得裂叶马兰的无菌材料。将无菌材料转移到底部覆有2层滤纸并经过无菌处理的培养皿中，准备剪切嫩茎接种[10]。固体培养基中琼脂含量为5.0 g·L-1，pH值5.8～6.0，每日持续光照12 h，光照强度为2 500 lx，恒温25 ℃培养。 　　1.2 方 法 　　1.2.1 不同浓度细胞分裂素与NAA、2，4-D对嫩茎段愈伤组织诱导培养的影响 以MS+ 蔗糖35 g·L-1为基本培养基，在添加不同浓度细胞分裂素与NAA、2，4-D的培养基上接种培养长0.3 cm左右的无生长点嫩茎段，进行愈伤组织的诱导培养。愈伤组织诱导培养在恒温光照的培养箱中进行。重复3次，每种处理培养50个材料。 　　1.2.2 不同浓度6-BA、ZT和KT与不同浓度的NAA、IBA对愈伤组织分化培养的影响 将在MS+ 蔗糖35 g·L-1 +6-BA0.5 mg·L-1+2，4-D2.5 mg·L-1培养基上继代增殖培养58 d的愈伤组织，用枪状镊子在培养瓶内将其分散为0.3 cm左右的颗粒状后，接种在以MS+蔗糖30 g·L-1+ AgN031.0 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1为基本培养基，再添加不同浓度6-BA、ZT和KT与不同浓度的NAA、IBA的培养基上，进行愈伤组织分化培养试验。愈伤组织分化培养试验重复2次，每种处理培养50个材料。其培养条件与愈伤组织诱导培养的条件相同。 　　1.2.3 不同培养基对裂叶马兰不定芽生根培养的影响 配制8种不定芽生根培养基，即1/2MS+蔗糖20 g·L-1+IAA 0.3 mg·L-1、1/2MS+蔗糖20 g·L-1 + IBA 0.3 mg·L-1、1/2MS+蔗糖20 g·L-1 + NAA 0.3 mg·L-1、1/2MS+蔗糖20 g·L-1 +2，4- D 0.3 mg·L-1、1/2MS+蔗糖20 g·L-1+IAA 0.6 mg·L-1、1/2MS+蔗糖20 g·L-1 + IBA 0.6 mg·L-1、1/2MS