壳聚糖酶分离纯化及性质研究.docVIP

壳聚糖酶分离纯化及性质研究 　　摘要：利用芽孢杆菌（Bacillus sp.）Yg菌株发酵产壳聚糖酶，采用分段醇析法分离纯化发酵产物，通过不连续SDS法测定壳聚糖酶相对分子质量。结果表明，发酵产物先用体积分数40%的乙醇初步醇析，离心去除沉淀，而后加乙醇至体积分数为60%再次醇析，所得沉淀冷冻干燥即为壳聚糖酶，所得酶的回收率和纯度均较高。所得壳聚糖酶的相对分子质量约为41.7 ku，最适反应温度为45 ℃，最佳反应pH为5.5。该酶在4 ℃条件下保存稳定性较好，在65 ℃及以上温度下短时间内即全部失活。 　　关键词：壳聚糖酶；发酵；纯化；酶活力；稳定性 　　中图分类号：TQ925+9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）15-3647-03 　　壳寡糖为壳聚糖降解产物，具有水溶性好、易吸收、无毒、无变异性的特性，具有很高的生物活性，应用领域广泛[1，2]。壳聚糖酶是专一性水解壳聚糖生成壳寡糖的酶，壳聚糖酶水解法是目前制备壳寡糖的最佳方法[3]。我国目前还没有自主研发的壳聚糖酶制品，壳聚糖酶的研究与开发利用已成为我国壳寡糖生产和应用的关键与瓶颈。本研究利用前期自行分离获得的产壳聚糖酶芽孢杆菌（Bacillus sp.）Yg菌株发酵产壳聚糖酶，对产物进行分离、纯化，并对壳聚糖酶的相关性质进行了研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　芽孢杆菌Yg菌株由廊坊师范学院生命科学学院提供。壳聚糖（脱乙酰度80%，国药集团化学试剂有限公司）。Marker：MBP-[3-galactosidase（175 ku）、MBP-CBD（62 ku）、Triosephosphate isomerase（32.5 ku）、β-Lactoglobulin A（25 ku）。丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、β-巯基乙醇、溴酚蓝、过硫酸铵、考马斯亮蓝R-250、无水乙醇、冰醋酸均为分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 粗酶液制备及活力测定 Yg菌株接种PDA液体培养基，37 ℃、180 r/min培养14 h制备种子液，按5%的接种量接于产酶培养基（NaCl 5 g/L、KCl 5 g/L、MgSO4·7H2O 5 g/L、K2HPO4 0.75 g/L、FeSO4 0.01 g/L、蛋白胨 8.5 g/L、牛肉膏 0.25 g/L、壳聚糖 10 g/L，pH 7.5～8.0）中，30 ℃、180 r/min发酵培养24 h，发酵液5 000 r/min、4 ℃离心20 min得粗酶液。45 ℃预热后将粗酶液按10%的体积分数加入30 g/L的壳???糖胶体溶液中，45 ℃、180 r/min条件下反应，定时取样，1 mol/L NaOH 调节pH 8.0，沸水浴20 min终止反应，离心取沉淀，烘干称重，计算酶活力。以每分钟催化1 μg不溶性壳聚糖转化为水溶性低聚糖所需要的酶量作为一个酶活力单位（U）[4]。 　　1.2.2 壳聚糖酶的分离及活力测定 发酵液中加入无水乙醇至乙醇体积分数分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%，4 ℃静置过夜，5 000 r/min、4 ℃离心10 min[5]，分别测定上清液与沉淀中的壳聚糖酶活力，确定分离壳聚糖酶的乙醇浓度。在最适条件下对壳聚糖酶进行醇析分离，真空冷冻干燥制得壳聚糖酶粉。壳聚糖酶粉加蒸馏水溶解，按“1.2.1”方法测定其活力。 　　1.2.3 壳聚糖酶相对分子质量的测定 采用不连续SDS电泳[6]测定壳聚糖酶相对分子质量。制胶、上样后10 mA电泳分离，指示剂到达浓缩胶与分离胶分界线时调电流为20 mA，电泳后去除浓缩胶、染色、脱色。依据样品与标准蛋白样品的相对迁移距离计算壳聚糖酶的相对分子质量。 　　1.2.4 壳聚糖酶反应条件研究[7] 分别于25、35、45、 55、65 ℃条件下测定壳聚糖酶活力，确定该酶的最适反应温度；分别于pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0条件下测定壳聚糖酶活力，确定该酶的最适反应pH。 　　1.2.5 壳聚糖酶热稳定性研究[8] 将壳聚糖酶分别置于4 ℃、25 ℃（室温）、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃条件下保存一定时间后测定酶活力。 　　2 结果与分析 　　2.1 壳聚糖酶醇析条件的选择 　　经测定，原酶液中壳聚糖酶活力为1 895 U/mL。不同体积分数的乙醇醇析后，分别测定上清液与沉淀中壳聚糖酶的酶活力，并换算为原酶液每毫升所得上清液及沉淀的酶活力，测定结果见表1。从表1可以看出，随着乙醇体积分数的升高，上清液中酶活力逐渐降低，当乙醇体积分数高于50%时，上清液中残余酶活为0；而沉淀中酶活力随乙醇体积分数的升