以生物羊膜为载体体外培养人角膜缘上皮细胞的实验研究.ppt

以生物羊膜为载体体外培养人角膜缘上皮细胞的实验研究 上海交通大学附属第一人民医院眼科 研究背景 角膜病是我国主要的致盲眼病之一 。 1990年以来国内的资料提示角膜盲约占全国盲人的的1/4 。 角膜移植是目前治疗角膜盲的唯一途径。但相当一部分患者单纯的角膜移植并不能持久地维持角膜的透明状态，提高患者视力。 角膜缘干细胞理论的建立 1971年，Davanger等研究发现角膜缘是角膜上皮增殖和移行的动力根源，据此提出角膜缘干细胞存在的假说 。 1986年，Schermer等首次通过试验发现角膜缘基底细胞缺乏特异性分化蛋白K3，为角膜缘干细胞的解剖部位提供了间接依据。 角膜缘干细胞的解剖定位 角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界的部分 在基底部乳头形成特殊的“栅栏”(limbal palisades of vogt)样结构 角膜缘干细胞理论建立的意义 认知了多种眼表疾病的发病机理 找到了许多眼表重建手术及角膜移植术失败的原因 角膜缘干细胞破坏的临床表现 结膜上皮侵入角膜 角膜纤维血管翳 反复或持续发生的角膜上皮缺损，甚至瘢痕化 角膜溶解穿孔 严重的视力下降 角膜缘干细胞移植的意义 角膜缘干细胞移植是角膜缘干细胞缺乏患者恢复眼表完整性和重建边缘屏障作用的有效方法。 角膜缘干细胞移植的局限性 异体供眼来源有限，而且存在免疫排斥反应，可能导致移植失败。 对单眼角膜缘干细胞受损患者的健眼取材（大于2/3圆周）有造成健眼角膜缘干细胞缺乏的潜在威胁 。 因此目前认为对角膜缘干细胞先行体外培养扩增后再行移植术是非常有前景的治疗方法。 角膜缘干细胞体外培养的应用前景 用合适的载体，将取材的角膜缘干细胞体外培养,孵育到足够的细胞数，再移植至患眼,从而重建眼表角结膜缘。 1.取材 2.培养 3.移植 载体 完整羊膜 去上皮羊膜 纤维蛋白凝胶 角膜接触镜 研究内容 本课题设计使用冷冻干燥羊膜即生物羊膜作为载体培养角膜缘上皮细胞,并且以组织块直接贴壁法和酶消化法对照比较角膜缘上皮细胞的生长情况 。 技术路线 在角膜移植术后的供体眼球上取角膜缘组 织。 选择生物羊膜为载体。 采用组织块直接贴壁法和酶消化法培养角膜缘上皮细胞 。 应用免疫组化的方法检测k3和P63的表达进行培养细胞的鉴定。 实验流程 研究方法 ①角膜缘组织的取材 取一块大小为1×2mm2，深度为基质前的角膜缘组织一块。 ②生物羊膜 江西省科学院住友生物技术有限公司的产品 。 ⑤观察培养细胞的生长情况 2－3天换液一次，在倒置显微镜下观察角膜缘上皮细胞的生长情况。 ⑥培养细胞标记物染色 将培养的角膜缘上皮细胞固定，进行间接免疫组织化学染色。选用AE5抗角蛋白抗体，特异性识别角蛋白K3；4A4核转录因子p63的特异性抗体,特异性识别p63。 载体特点 冷冻干燥羊膜 钴-60辐照灭菌 有国家药物监督管理局批号的生物制品 生物羊膜 生物羊膜 实验结果 实验结果 讨论 优点：生物羊膜具有安全性检测；方便获得；易于保存。 缺点：柔韧性差，价格贵。 消化培养法将组织块分离更细，细胞爬出较组织块培养法快，平均5±2天见明显生长，组织块培养法为10±3.5天。 结论 生物羊膜可作为组织工程培养角膜缘上皮细胞合适的载体，具有较高的临床应用价值 。 组织块培养法细胞爬出较消化法慢，与载体贴附较差。 * * 硕士研究生 黄 洁 导 师 刘 焰 E-mail:glucos 结膜 角膜缘 周边角膜 中央角膜 Chen J, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci,1990;31:1301 Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93 Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93 Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93 试剂的选购 角膜缘上皮细胞取材 鉴定 两种方法培养细胞 ③灭活的3T3成纤维细胞的制备 融合的3T3成纤维细胞与4 μg/ml丝裂霉素在37℃，5％CO2共同培养2h。然后用胰蛋白酶作用，以2 x 104 个/cm2的密度装入塑料盘。 ④角膜缘上皮细胞的培养 采用组织块培养法和酶消化法。所用的培养基采用DMEM与F－12培养基1：1混合，加入10％胎牛血清，5ng/ml的胰岛素，10 ng/ml的上皮生长因子。消化酶使用0.25％胰蛋白酶－0.02％EDTA的混合物。