HPLC法测定不同制法四逆汤中3种苯甲酰类乌头碱及6—姜酚含量.docVIP

HPLC法测定不同制法四逆汤中3种苯甲酰类乌头碱及6—姜酚含量 　　摘 要 目的 建立高效液相色谱法同时测定四逆汤中苯甲酰类乌头碱、6-姜酚的含量，比较3种方法制备的四逆汤中有效成分含量差异。方法 苯甲酰类乌头碱的测定采用C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1 mol·L-1醋酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为235 nm，柱温30 ℃。6-姜酚测定采用C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）以乙腈-甲醇-水（ 40： 5： 55）为流动相等度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为280 nm，柱温25℃。结果 3种不同方法提取液中苯甲酰类乌头碱的提取率依次为：有效部位组合法药典法传统法。6-姜酚的提取率依次为：传统法药典法有效部位组合法 。结论 所建立的方法简单、准确，为四逆汤提取方法改进提供科学依据。 　　关键词 四逆汤 苯甲酰新乌头碱 苯甲酰乌头原碱 苯甲酰次乌头碱 6-姜酚 　　四逆汤出自《伤寒论》，由附子、干姜、炙甘草组成，用于阳虚欲脱，冷汗自出，四肢厥逆，下利清谷，脉微欲绝等证。近年来研究发现四逆汤具有很好的抗心肌缺血、再灌注损伤及保护心肌的作用[1～3]。炮制后的附子中单酯型生物碱是四逆汤抗心肌缺血的关键有效成分[4]，主要包括苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱等，干姜中的6-姜酚也是四逆汤重要有效成分之一，具有改善心肌舒缩性能，缓解心衰症状作用[5]。本实验采用HPLC法测定苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、6-姜酚的含量，比较传统水提法、药典收录的水提醇沉法及有效部位组合法制备的四逆汤中以上4种有效成分的含量差异，对四逆汤提取工艺的改进提供参考依据。 　　1 仪器与试药 　　Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司，四元泵、自动进样器、恒温箱、DAD检测器，Chem Station 色谱工作站）； Mettler AE240电子天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-250E型医用超声波清洗器（群山市超声仪器有限公司）；恒温振荡器（国华仪器有限公司）；RE-52C旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。 　　药材黑附子、甘草、干姜均购于山东济南建联中药店，经山东中医药大学生药系李峰教授鉴定??黑附子（毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.）的子根炮制加工品、干姜（姜科植物姜Zingiber officinale Rose.）的干燥根茎、甘草（豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的炮制加工品；苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、6-姜酚对照品（供含量测定用，成都瑞芬思生物科技有限公司，批号分别为RFS-B-100713、RFS-B-110305、RFS-B-110328、A0218，含量均 98%）；色谱用水为娃哈哈纯净水，乙腈、甲醇、乙醇、醋酸铵、异丙醇、二氯甲烷为色谱纯，其他试剂均为分析纯。 　　2 方法与结果 　　2.1 溶液制备 　　2.1.1 对照品溶液的制备 苯甲酰类乌头碱对照品的制备：分别精密称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱与苯甲酰次乌头原碱对照品适量，加入异丙醇-二氯甲烷（1：1）制成浓度分别为0.95 mg·mL-1、0.97 mg·mL-1、1.10 mg·mL-1的单一对照品储备液。分别精密吸取上述储备液适量于同一容量瓶中，用异丙醇-二氯甲烷（1：1）稀释至95 μg·mL-1、97 μg·mL-1、55 μg·mL-1，即得3种组分的混合对照品溶液。 　　6-姜酚对照品的制备：精密称取6-姜酚对照品适量，加75%甲醇制成0.7 mg·mL-1的对照品储备液。精密吸取上述储备液适量于容量瓶中，加75%甲醇制成浓度为70 μg·mL-1的6-姜酚对照品溶液。 　　2.1.2 3种不同制法四逆汤供试液的制备 传统汤剂：黑附子50 g，炙甘草50 g，干姜33 g（均过20目筛），加入8倍量水浸泡1 h后，煎煮30 min，过滤，残渣加6倍量水煎煮20 min，过滤，滤液合并，浓缩至250 mL，冷藏备用。 　　药典复方提取液：黑附子50 g，炙甘草50g（均过20目筛），加入8倍量水加热回流提取2 h，过滤，残渣加6倍量水再加热回流提取1 h，过滤，滤液合并。取干姜粉末33g（过20目筛），加12倍量水，水蒸气蒸馏提取5 h，蒸馏后水溶液备用，残渣加6倍量水煎煮1 h，过滤，煎液合并再与附子、炙甘草提取液合并，浓缩至100 mL，加无水乙醇300 mL，静置10 h后离心，取上清液，旋蒸浓缩至250 mL，冷藏备用。 　　有效部位组合液：黑附子粗粉50