2012全国分子细胞生物学实验技术培训班—Western bt 技术讲座.pptVIP

不连续电泳 凝胶层的不连续性：浓缩胶和分离胶。浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。 缓冲液离子成分和pH的不连续性：在两层凝胶中均有Tris和HCl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH。 浓缩胶 分离胶 5% pH6.8 12% pH8.8 步骤三 SDS张和胶一样大小的PVDF膜（甲醇活化）， 然后放在转移缓冲液中浸泡10min 转膜用的夹子，一支玻棒 两块海绵垫，滤纸 转膜缓冲液 转膜材料准备 铺滤纸 铺胶 铺膜及滤纸 固定于转移槽 转膜 将夹子打开使黑的一面保持水平 在上面垫一张海绵垫 在海绵垫上铺两层滤纸 用玻棒擀去其中的气泡 将玻璃板撬掉，轻轻刮去浓缩胶 小心剥下分离胶，在转移缓冲液中浸泡 取出盖于滤纸上，轻轻用玻棒擀去气泡 将膜盖于胶上，然后除气泡 在膜上盖2张滤纸并除去气泡 最后盖上另一个海绵垫，合起夹子 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面 在槽的一边放一块冰来降温； 接通电源，开始转膜 电转时间： 90V 1-2h，可根据蛋白分子量的大小灵活选择 步骤四 转印 转膜注意事项 注意事项： 1.转移单元无气泡 2.注意方向/ 3.戴手套，防止蛋白污染 4.胶和膜大小要一致 步骤五 封闭 作用：为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景； 用5％脱脂奶粉或5％BSA （含0.1％Tween20 TBS或PBS配制） 时间：室温1.5h，温度较高时可减少孵育时间； 步骤六 免疫反应 一抗：将一抗用含5%牛奶的TBST稀释至适当浓度，4℃ 孵育过夜，后取出用TBST洗三次，每次8分钟； 二抗：同上方法准备二抗稀释液并室温下孵育1.5小时，然后用TBST洗三次，每次8分钟； 常用内参 内参名称 分子量大小 适用范围 Beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞 GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞 Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞 VCDA1/Porin 31kDa 线粒体 COXIV 16kDa 线粒体 Lamin B1 66kDa 细胞核 TBP 38kDa 细胞核 步骤六 免疫反应 步骤七 显色（ECL试剂盒） 辣根过氧化物酶（ HRP ）：HRP 是最常见的酶促发光或显色的交联酶。 碧云天生产的荧光检测试剂BeyoECL?Plus是一种超敏ECL化学发光试剂盒，可与二抗上耦连的辣根过氧化物酶发生化学反应，发出荧光，从而可以通过用X光片压片或其它适当荧光成像设备检测样品。 步骤七 显色 1、二抗孵育后，进行数次洗涤，将膜取出，除去过多的液体(勿接触膜的蛋白面)，然后置于一洁净保鲜膜上。2、根据膜的大小，滴加BeyoECL Plus工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置1-2分钟。3、取膜，弃BeyoECL Plus工作液。将膜放在新两片保鲜膜中间，随后进行压片检测或荧光成像仪检测。4、压片检测：将膜固定于片夹内。曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定； 常见问题分析 常见问题分析 向上的“微笑”现象说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，所以导致凝胶中分子有不同的迁移率所致，这种情况在用较厚的凝胶时常发生; 向 下的“皱眉”现象常常是由于凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种 现象。 常见问题分析 “拖尾”现象是电泳中最常见的现象。这常常是由于样品溶解不佳引起的 解决办法 一、加样前离心，选用合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液,加增溶辅助试剂。 二、是降低凝胶浓度。 常见问题分析—样本量少 浓缩步骤 1 样品中加入5倍样品体积的丙酮(-20度预冷后)，-20度过夜；2 5000g，4度，离心10分钟；弃上清，待样品中丙酮挥发完后加入裂解液溶解。 浓缩浓度： 最好在1mg/ml以上。 丙酮沉淀应该是用裂解液溶解后的样品，因为丙酮沉淀后样品不易溶解。 可能的原因 一抗浓度过高 二抗非特异性结合 洗膜不充分 一抗或二抗与封闭剂 有交叉反应 常见问题分析-背景高 常见问题分析-阳性条带很弱 可能的原因 一抗、二抗等不匹配 转膜不充分,或洗膜过度 二抗受叠氮钠抑制 曝光时间过短 一抗或/和二抗浓度低 常见问题分析-条带位置不对 可能的原因 表达的蛋白具有多种修饰形式（磷酸化、甲基化等） 二抗浓度过高，产生的非特异性结合 蛋白存在二聚体或多聚体 蛋白样本降解 WWW.YRBIO.COM 2012年07月 * * 当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用。 * * 2012年7月 WWW.YRBIO.COM Western blot Western blot Western blo