重组人甲状旁腺激素肽（-）在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化.docVIP

重组人甲状旁腺激素肽（1-34）在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化 中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2006,26(3):26～30 重组人甲状旁腺激素肽(1—34)在大肠杆菌中 的高效融合表达及纯化木 李健峰肖红剑姬秋彦李智华龙海亭阎玲梅罗娜徐维明 (中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所昆明650118) 摘要人工合成人甲状旁腺激素1～34肽段(PTH1-34)的cDNA序列,克隆到大肠杆菌蛋白表达 载体pThioHis中,获得了高表达菌株.经发酵,破茵,金属螯合层析,反相层析和凝胶层析后获得 了纯度大于95%的hPTH1-34,hPTH1.34肽N端测序和质谱分子量测定结果与天然PTH1.34一 致.生物学活性研究表明,hPTH1-34在体外具有刺激腺苷酸环化酶的作用. 关键词人甲状旁腺激素大肠杆菌融合表达 人甲状旁腺激素(parathyroidhormone,PI1H)是生 物体内由甲状旁腺主细胞分泌的一种多肽激素,在调 节体液钙磷浓度维持相对稳定的过程中发挥着重要作 用….PI1H分子是由84个氨基酸组成的一条直肽链, 研究发现,完整的多肽对其生物学活性是非必须的,发 挥钙磷调节作用仅需N端1～34氨基酸残基组成的肽 段【2l.PI1H1-34通过与受体结合后激活腺苷酸环化酶 系统和蛋白激酶c的活性,改变骨吸收和骨合成的速 率,影响骨代谢llJ.目前临床研究显示,PTH104在低 浓度的间歇注射可以促进骨合成速率,提高骨质密度 和骨质量,有效治疗低血钙导致的骨质疏松症-3J.传 统的由动物组织中提取PTH的方法,效率和产量极低, 限制了PTH的研究和应用,因此,利用基因工程技术高 效地生产具有生物学活性的重组PTH134具有实际应 用价值.利用基因工程技术,在大肠杆菌中高效融合 表达了hPTH1-34,并对hPTH1—34发酵工艺和纯化工艺 进行了研究. l材料与方法 1.1材料 pThioHis—A质粒,E.coliDH5ct,E.coliBL21为本 研究室保存;大鼠骨肉瘤细胞株ROS17/2.8来源于中 收稿日期:2005-06-29修回日期:2005—10—31 云南省自然科学基金资助项目(2005C0062M) 通讯作者,电子信箱:xuwmyn@ 国农业大学生物学院;羊抗人PI1H1.34抗体购自Santa Cruz公司;cAMP放射免疫分析试剂盒购自中国原子能 科学研究院;各种工具酶购自TaKaRa公司及华美生物 工程公司;牛肠激酶为本实验室酵母表达生产所得. 1.2人PTH1-34DNA片段的合成,克隆及融合表达载 体的构建 在不改变氨基酸序列的前提下,选择来自WWW. kazusa.or.jp/code网站的大肠杆菌偏爱密码子,并考虑 二级结构因素,设计了编码人PTH1-34的DNA序列. 并在上游酶切位点BamHI和PTH1.34基因起始密码子 之间引入编码肠激酶切割识别位点AspAspAspAspLys 的碱基序列GACGACGACGACAAG.设计后的基因由 TaKaRa公司合成后,与BamHI和EcoRI双酶切的载体 pUC18连接.转化EcoliDI-15a,筛选重组子和测序 后,获得了一个序列完全正确的质粒,命名为pUC18. PTH(1—34). 质粒pUC18一erH(1—34)用BamHI和EcoRI双酶切切下 1∞bp小片段,与用BamIII和EcoRI双酶切的pThioHis.A载 体连接,获得了表达硫氧还蛋白(Thioredoxin)和PTH1 34融合蛋白的质粒pThioHis,PTH1-34. 1.3工程菌的构建及融合蛋白的表达 将表达质粒pThioHis—PTH1_34转化到E.coliBL21 中构建了工程菌E.coliBL21一PTH1.34.该工程菌接 入含有50~g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中. 37℃,180r/m,培养至OD6oo达O.4～0.6h,以终浓度 为0.4mmol/L的IPTG诱导表达4h.取培养物1mI,离 2006,26(3)李健峰等:重组人甲状旁腺激素肽(1—34)在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化27 心后采用SDS—PAGE鉴定表达量.Westernblot鉴定所 表达的融合蛋白,～抗为羊抗人PTH1—34,二抗为碱性 磷酸酶标记的马抗羊IgG. 1.4发酵培养 1.4.1培养基组成LB种子培养基:每L含蛋白胨 10g,酵母粉5g,NaC15g,pH7.0;高压灭菌,使用时加入 氨苄青霉素至100p.g,/ml. 发酵培养基:每L含蛋白胨6.67g,酵母粉3.33g, 葡萄糖1.67g,KH2PO4?3H2O3.33g,NaC13.33g, MgSO4?7H201.67g,柠檬酸三钠1.33g;高压灭菌后