青岛农业大学农学与植物保护学院植物分子育种概论课件第十一章 外源基因整合及表达的检测.ppt

测定时要注意两个问题： ①蛋白质溶液的紫外吸收锋与溶液的pH有关，测定溶液的pH值应与标准曲线制定时的pH一致； ②蛋白质溶液的浓度在20～100ug／ml范围才符合Beer-定律。 (2)双缩脲法 一般蛋白质分子中含有两个以上的双键，在碱性溶液中与Cu2+形成蓝紫色的络合物，颜色深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质分子的氨基酸组成及分子质量无关，这样可通过测定蛋白质溶液在540nm处的吸收值求出其含量。该方法测定范围在1～10mg蛋白质，测定结果不十分精确。 (3)Folin试剂法 Folin试剂为复合磷钼酸试剂，由磷钼酸及磷钨酸组成，也称为Folin-Ciocalteu试剂。蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸与该试剂反应生成蓝色物(钼蓝与钨蓝的混合物)，于540nm进行比色测定，可求出蛋白质含量。 (4)Lowry法 该方法是在双缩脲法及Folin试剂法基础上发展起来的。 试剂由两部分组成: 一是碱性的硫酸铜溶液 另一部分是复合的磷钼酸试剂(Folin试剂)。 反应包括两步: 第一步是在碱性溶液中蛋白质与Cu2+反应形成铜-蛋白质复合物(似双缩脲反应): 然后这个复合物还原Folin试剂，产生深蓝色的钼蓝及钨蓝混合物，可通过比色法测定。 该方法的灵敏度为5μg。 (5)Bradford法 该方法简单、快速、可靠。其原理是考马斯亮蓝与蛋白质结合产生蓝色，在595nm有最大吸收。 由于4-MU羟基的pKa在8～9之间，欲使羟基解离，溶液的pH应高于其pKa，一般使用碳酸钠终止反应并创造碱性的测定条件。 3、分光光度法测定GUS活性 对硝基苯基-β-D葡萄糖醛酸苷(PNPG)是该法的最好底物。 Gus将其水解，生成对硝基苯酚，在pH7.15时离子化的发色团吸收400～420nm的光，溶液呈黄色，酶反应在(pH7.0)条件下进行，随反应进行，产物生成，渐渐碱化，显色增强。 测定步骤与荧光法大致相同，以对硝基苯酚为标准样品，分别在反应开始后不同时间取样，终止反应后于415nm测消光值。 （二）Cat基因(氯霉素乙酰转移酶)的检测 Cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，该酶催化氯霉素发生乙酰化，使氯霉素失去干扰蛋白质合成的活性。 大多数真核细胞不含Cat基因，无内源活性，因而Cat基因也可作为真核细胞转化的标记基因及报告基因，Cat基因转化的植物细胞能够产生对氯霉素的抗性，并可通过对转化细胞中氯霉素乙酰转移酶活性的检测来了解外源基因的表达。 Cat活性可以通过反应底物乙酰CoA的减少或反应产物还原型CoA SH和乙酰化氯霉素的生成来测定，目前常用的方法有硅胶G薄层层析法及DTNB分光光度法。 1薄层层析法 氯霉素和它的乙酰化产物可以用硅胶薄层层析法进行分离。 氯霉素易溶于甲醇、乙醇、丙醇及乙酸乙酯，而微溶于氯仿。 氯霉素及它的三种乙酰化产物在氯仿中的溶解度不同，因而在用氯仿作扩展剂进行薄层层析时，四种物质的Rf值不同，扩展剂中加入5％的甲醇可以增加这种效果。 将待测材料的提取液与乙酰辅酶A及用14C标记的氯霉素混合，在适宜的温度下保温； 保温后，用乙酸乙酯萃取，蒸发掉乙酸乙酯后再用少量乙酸乙酯溶解，制成样品液； 然后以氯仿：甲醇(19：1)的混合液为扩展剂，进行硅胶薄层层析，通过放射自显影检测乙酰化产物的生成。 氯霉素、1-乙酰氯霉素、3-乙酰氯霉素、l,3-二乙酰氯霉素的Rf值依次增加。 如果被检材料未发生Cat基因转化，则样品液中无乙酰化产物，只有氯霉素，放射自显影后，X线片上只有一个曝光点。 如果被检材料为转化体，x线片上则出现四个曝光点，各点的强度随保温时间不同而不同，保温时间增长，l,3-二乙酰氯霉素含量增多。 2、DTNB法 其原理是反应产物CoASH具游离的巯基，能与DTNB (5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid)发生反应。 反应生成的乙酰化氯霉素与CoA SH的摩尔数相等，CoA SH的摩尔数可由其与DTNB反应产物对412nm的光吸收求出。 使用该方法需注意： ①反应体系中应无其他的含巯基化合物。 ②防止硫脂酶对乙酰CoA的水解作用。 一般植物粗提液中硫脂酶含量较高，要想得到可靠的结果，需从粗提液中纯化出CAT。 （三）Npt-Ⅱ基因的检测 该基因编码氨基糖苷-3’-磷酸转移酶(Aminoglycoside-3’-phosphotransferasⅡ)，该酶使氨基糖苷类抗生素(新霉素、卡那霉素、庆大霉素、巴龙霉素和G418等)磷酸化而失活。 检测原理是使用放射性标记的[γ-32P]ATP，通过γ-磷酸基团转移，生成带放射性的磷酸卡那霉素。 具体方法有三种： 1、点渍法 2、层析法 3、凝胶原位检测法 1、点渍法： 点渍法是利用Whatman P81磷酸纤维素纸对卡