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基于选择性剔除红花抗氧化效应物质基础研究 　　[摘要] 目的：建立一种从整体角度研究中药效应物质的方法。方法：以红花为例，利用制备液相色谱剔除其主要成分，然后分别对剔除后的样品进行抗氧化效应评价，进而比较分析得出红花抗氧化活性的主要效应物质及各成分的贡献度。结果：从红花样品中分别剔除了7个主要物质，并通过质谱数据分析和对照品对照鉴定了其中6个成分。通过对包括剔除物质在内的所有样品进行抗氧化效应比较评价，结果发现羟基红花黄色素A，脱水红花黄色素B，6-羟基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖-7-氧葡萄醛酸苷是红花抗氧化活性的主要效应物质。结论：该研究探索了一种较新颖而有效的中药效应物质的研究方法，通过这种方法，能从一定程度上阐明不同成分对中药效应表达直接或间接的贡献以及贡献度，使得中药效应物质表达更加明晰。 　　[关键词] 选择性剔除；红花；抗氧化；效应物质 　　中药在中医理论指导下为广大民众应用数千年，疗效确切，其发挥疗效的是中药所含的复杂物质基础[1]。近年来，随着现代分析、分离技术的不断发展，中药物质基础研究取得了较大进展，新思路和新方法不断涌现，如基于组合化学或化学物质组学概念的中药药效物质基础研究、血清药物化学与血清药理学相结合的研究方法、基于谱效关系或组效关系的中药物质基础研究、基于亲和色谱和分子烙印技术的中药物质基础研究、基于药物代谢的中药物质基础研究、基于计算机虚拟筛选技术的中药物质基础研究等[2]。但这些研究方法大多仅从某一侧面或模糊地研究中药物质基础，其“发现”的有效成分往往都是传统方法早已确证的有效成分，难以真正地阐明中药物质基础及其相互作用，且无法完整地将不同功效活性归属于目标成分。如有正反两方面的数据，即含有该成分有活性反应，去除该成分则活性减弱甚至消失，可明确地将该活性归属于目标成分，从而完成中药有效成分的辨识。 　　制备液相色谱系统在中药研究中大多应用于化学成分的分离和纯化，鉴于现代制备液相色谱高效的分离性能及收集触发功能可以尝试用于进行中药中成分或化学特征部位的剔除。本研究即以红花为例，利用制备液相色谱技术分别剔除红花中的不同成分，结合活性实验，评价这些成分在中药效应表达中的贡献，进而阐明红花效应物质，这将为中药物质基础研究提供一种新的思路与方法。 　　1材料 　　1.1药物及试剂 　　红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，购自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，产于新疆，并经南京中医药大学王春根教授鉴定，符合《中国药典》2010年版项下标准。 　　腺苷（99%，Sigma公司），羟基红花黄色素A（92.5%，江苏省食品药品检验所）。FeSO4·7H2O，水杨酸，过氧化氢（H2O2）购买于无锡市亚盛化工有限公司；DPPH（1，1-di-phenyl-2-picryhydrazyl）购自于ALDRICH Chemistry；ABTS（2，2′-azinobis-3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonic acid）、三吡啶三嗪（2，4，6-tripyridyl-s-triazine，TPTZ）购自于Sigma公司。超纯水自制，甲醇（色谱纯，中国汉邦），其他试剂均为分析纯。 　　1.2仪器 　　旋转蒸发仪（BUCHI labortechnik AG，瑞士）；超纯水仪（南京易普易达科技发展有限公司）。Waters 2695-2998 PDA，Hypersil ODS2分析色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）。Waters自动纯化系统（2545二元高压梯度泵，2767自动进样及收集器，泵控制器，2489双波长检测器；FractionlynxTM工作站），XBridgeTM C18 OBDTM制备柱（30 mm×150 mm， 5 μm）。Enspire型多功能酶标仪（美国Perkin Elmer公司）。 　　2方法 　　2.1制备用样品制备 　　称取红花药材400 g，精密称定，浸泡30 min，分别用24倍和20倍量30%乙醇，80 ℃下温浸2次，每次各60 min，趁热过滤，60 ℃以下减压浓缩至约生药1 g·mL-1，此即为红花样品（HH）。 　　2.2红花不同成分的剔除 　　称取上述各样品适量，10%甲醇溶解，质量浓度约为300 g·L-1，13 000 r·min-1离心10 min，上清液注入制备液相系统，进样体积为500 μL；流动相为水（A）-甲醇（B）；流速20 mL·min-1；检测波长270 nm（各目标成分在此波长下均有较强吸收）；根据不同成分确定不同的洗脱程序，各成分的最佳洗脱程序见表1。依据保留时间分别收集目标成分1～7，10 mL/管，同时收集剔除目标成分的溶液，60 ℃以下减压回收，即