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2、研究内容： 存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成 内容分散，不能集中阐明研究目标 撰写要求：内容要适当—确保研究周期内完成 为目标服务—与目标相辅相成 要重点阐述—注意与技术路线区别 * 举例： （1）筛选白内障相关基因：采用改良的消减杂交技术，获得人老年性白内障晶状体上皮细胞和正常晶状体上皮细胞差异表达的基因片段，建立cDNA文库。制备差异表达基因的基因芯片，利用基因芯片技术从多个标本的老年性白内障晶状体上皮细胞中筛选出白内障相关基因。 * （2）研究白内障相关基因的结构：…… （3）研究白内障相关基因在晶状体上皮细胞变化中的作用：…… 观察指标如下： ①存活细胞数；②光镜、透射电镜下细胞形态的变化；③细胞凋亡检测：用原位末端标记和连接酶介导PCR方法，从形态和DNA水平分析细胞凋亡；④细胞增殖的检测：……；⑤细胞骨架蛋白的检测：……；⑥晶状体蛋白的检测： * 3、拟解决的关键问题： 存在问题：抓不住关键问题或抓得不准。 什么是关键问题 ？ --研究过程中对达预期目标有重要影响的某些研究 内容或因素。 --为达预期目标所必须掌握的关键技术或研究手段。 撰写要求：找出关键问题，提出解决办法。 * 举例： （1）建立差异表达的cDNA文库： 建立差异cDNA文库是筛选老年性白内障相关基因的前提。为使差异cDNA文库具有代表性，我们采取以下解决方案： ①选择各种类型老年性白内障晶状体的前囊膜、取足够大量的标本（拟取50例标本）作为建库的mRNA的来源。 ②利用改良的消减杂交技术可快速、有效地获得差异表达的完整cDNA片段。此技术是本课题组成员主要的研究成果，在应用此项技术中已积累了较丰富的实验经验。 * （2）制备基因芯片： 制备用于本研究的芯片是筛选老年性白内障相关基因的关键环节。制备基因芯片的关键是在 1平方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探针而不使它们发生任何混淆。在制作基因芯片时做到：①严格按操作程序进行；②在标本的处理及RNA提取时避免污染，否则即会造成严重的损失。只要严格按操作程序进行操作就可以避免发生差错。 * （3）在体基因转染： 在体基因转染是进行白内障相关基因功能研究的关键。在体的晶状体上皮细胞大部分处在静息状态，只有位于赤道前区的少量细胞具有分裂活性，而且晶状体表面有一层胶原性质的囊膜包裹。在体晶状体的基因转染的关键是如何使大量分裂后细胞转染，如何使病毒穿过晶状体的囊膜，针对以上问题我们拟采取下列方法解决：①选用反转录病毒的慢病毒载体（ lentiviral vector ），它克服了一般反转录病毒只能转染有分裂能力细胞的局限性，对分裂后细胞也能有效的转染。这对在体晶状体的基因转染有很大的优越性。②采用直径1-2μm玻璃微管在显微镜下将病毒载体注入晶状体的前囊膜下，既不破坏晶状体的完整性，又可使病毒接触到囊膜下的上皮细胞。 * 4、研究方法 存在问题： 过于简单：在方案中只有方法名称而无具体步骤。 过于繁杂：大量罗列一些常规的实验方法。 撰写要求：以研究项目的需求为前提，尽量采用最适合的方法和手段，并将其操作步骤和关键环节体现在技术路线当中。 * 5、技术路线 存在问题： 不清楚，不详细，不可行。 撰写要求： 清晰、详细、注意逻辑性。 撰写方法： —以时间顺序为主线设计技术路线 —以研究内容为主线设计技术路线 —分大小标题，突出逻辑关系。 —详细地写清楚每个具体步骤。 * （1）人晶状体上皮细胞的获得：老年性白内障晶状体上皮细胞取自白内障患者手术中取出的前囊膜（晶状体上皮细胞紧贴于前囊膜），直径约5mm。正常晶状体上皮细胞取自角膜移植供体眼的晶状体，在显微镜下撕下前囊膜，直径约8mm。按文献提供的方法去除晶状体纤维细胞，仔细清洗以去除血细胞污染。 （2）建立差异cDNA文库：从50例白内障手术患者的前囊膜上取下的晶状体上皮细胞作为实验组，从25例正常晶状体前囊膜上取下的晶状体上皮细胞作