三七对酒精肝大鼠肝组织TGF—β1Smads,CTGF表达量影响.docVIP

三七对酒精肝大鼠肝组织TGF—β1Smads,CTGF表达量影响 　　摘要 目的：研究三七对酒精性肝损害大鼠肝脏TGF-β1/Smads，CTGF的影响，探讨三七对酒精性肝硬化的保护作用机制。方法：50只SD大鼠随机分成正常对照组、模型组、三七高、低剂量组、异甘草酸镁组，除对照组外大鼠灌服白酒-玉米油-吡唑混合液14周建立酒精性肝病模型，造模同时三七高、低剂量组分别灌服12，3 g·kg-1，异甘草酸镁组腹腔注射24 mg·kg-1，每天给药1次，连续14周。测定肝功能、大鼠肝脏Masson染色病理学检查，以及各组大鼠肝组织TGF-β1，Smad3，Smad7，CTGF mRNA的表达量。结果：与模型组比较，治疗组能明显降低肝脏ALT，AST，抑制胶原纤维沉积，减少肝组织TGF-β1，Smad3，CTGF mRNA的表达量，增加Smad7 mRNA的表达量，三七组不同剂量组之间存在显著性差异，高剂量三七组与异甘草酸镁组之间无显著性差异。结论：三七可以影响TGF-β1/Smads信号通路，减少CTGF表达。 　　关键词 三七；酒精性害；TGF-β1/Smads；CTGF 　　收稿日期 2013-01-09 　　通信作者 *周于禄，Tel：（0731E-mail：yulu0027@126.com 　　作者简介 张赞玲，博士研究生，E-mail：yulu0027@126.com 　　随着我国酒的消耗量增加，酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）在临床发病率逐年增多，已成为继病毒性肝炎之后导致肝脏损害的第二大病因，我国一般人群中ALD检出率高达4.34%[1]。在嗜酒者中，约2/3可发展为酒精性肝病。目前酒精性肝病是引起肝硬化重要因素之一。中药三七具有较广泛的药理学特性，在抗肝纤维化方面取得了一些令人鼓舞的成绩，但目前应用对急性酒精性肝损伤相关报道仍较少见，且其具体作用机制尚不明确。本研究以急性酒精性肝损伤大鼠为模型，观察三七对急性酒精性肝损伤的保护作用，并进一步探讨其可能的作用机制。 　　1 材料 　　1.1 动物 健康成年普通SD大鼠，雄性， SPF级，体重（199.45±6.99） g，由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供。 　　1.2 药物及试剂 三七购自湖南中医研究院药房，由湖南省中医药研究院周知午副主任药师鉴定。水提物的制备[2]：三七粉碎后称取100 g，加水300 mL，在500 mL烧杯中浸泡过夜。用数控超声波清洗器65 ℃超声1 h后倒出上清液，沉渣再加水300 mL，重复以上步骤。合并2次上清液，加热蒸发浓缩至200 mL。使用时均稀释至667 mL，即三七溶液质量浓度为150 g·L-1。市售高粱白酒，酒精体积分数50%，产自北京牛栏山酒厂。异甘草酸镁（商品名天晴甘美），江苏正大天晴药业，国药准字 　　2 方法 　　2.1 造模方法及分组[3] 雄性大鼠50只，随机取10只为空白对照组，其余40只灌服白酒-玉米油-吡唑混合液（其中56度白酒5 g·kg-1·d-1、玉米油2 mL·kg-1·d-1、吡唑27.2 mg·kg-1·d-1），每天1次，固定时间喂食，自由饮水，以普通大鼠饲料喂，连续14周。再随机分成模型组、三七低、高剂量治疗组、异甘草酸镁组。三七高、低剂量组分别灌胃水提物（12，3 g·kg-1）；异甘草酸镁腹腔注射24 mg·kg-1，对照组和模型组给予等量双蒸水灌胃。每天1次，连续14周。 　　2.2 肝功能检测 处死前12 h禁食， 3%戊巴比妥麻醉，腹腔静脉取血离心血清，按试剂说明书方法测定谷草转氨酶（AST） 、谷丙转氨酶（ALT）含量。 　　2.3 大鼠肝组织Masson染色镜检 取小鼠肝脏右前叶置入40 g·L-1多聚甲醛溶液中，固定24 h后转入含0.02%叠氮化钠的PBS保存液中，切成约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的组织块，分别标号后按程序组织脱水，石蜡包埋，脱蜡切片，行肝组织Masson染色后镜检。 　　2.4 RT-PCR 法检测肝组织TGF-β1，Smad3，Smad7，CTGF mRNA的表达量 ①按RNA抽提试剂TRIzol推荐的操作步骤抽提总RNA，紫外分光光度仪和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度、纯度和完整性。②逆转录反应（采用M-MLV 第一链cDNA 合成试剂盒） ： 用上述组织中提取的5 μg总RNA 在下述20 μL反应体系中逆转录成cDNA；反应参数为42 ℃反应60 min，70 ℃反应10 min终止反应。③取上述逆转录反应产物于25 μL反应体积中进行PCR 反应，95 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，TGF-β1在60 ℃，Sma