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溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白 第28卷第9期 2009年9月 分析试验室 ChineseJournalofAnalysis Vo1.28.No.9 2【x)9—9 溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白 严志红,朱明芳,唐睿,仇志坤 (广东药学院药科学院,广州510006) 摘要:在pH3.3的Britton—Robinson(B—R)缓冲溶液中,对溴甲酚绿(BCG)与牛 血清白蛋白(BSA)相互作用的吸收光谱进行了初步研究.结果表明:BCG与 BSA作用在室温下能迅速结合成复合物,并且随着BSA的浓度增大,在444Bin 处的吸收峰降低,618r.rr.处吸收峰升高并红移至628lqln.在此波长下测定其复 合物的吸光度,其吸光度的增加值(△)与BSA的质量浓度在8～260/~g/mL范 围内呈良好的线性关系(r=0.9996),检出限为4g/mL.该方法应用于鲜奶粉 和液态纯牛奶样品中总蛋白的测定,回收率分别为92.7%,95.5%,结果与考 马斯亮蓝G250法基本一致. 关键词:溴甲酚绿;分光光度法;牛血清白蛋白 中图分类号:0657.3文献标识码:A文章编号:1000—072(】(2009)O9—082—03 蛋白质的定量分析是生命科学和临床医学及 食品营养学中的重要课题,目前的测定方法有紫 外.可见分光光度法,荧光法,化学发光法_】.],电 化学法[3等,其中因分光光度法简单,快速,重现 性好等优点而受到人们关注.常用的光度法在反 应时间,选择性,灵敏性及重现性等方面各有优 缺点.溴甲酚绿(BCG)是一种应用较广泛的蛋白 质染色剂.本文基于牛血清白蛋白(BSA)与BCG 在酸性介质和室温条件下迅速结合成复合物,建 立了测定蛋白质的简便,快速,选择性好的分析 方法. 1实验部分 1.】仪器与试剂 PHS一25数显酸度计(上海仪器仪表公司);紫 外可见分光光度计(uvl101,上海天美科学仪器公 司);BSA(德国默克公司,广州泽元贸易公司分 装,纯度:98.0%,2mg/mL);BCG(天津天心精细 化工开发中心,1.14×10mol/L);Britton—Robin— SOB缓冲溶液(pH3.3),牛奶粉(安怡,恒天然乳品 公司);鲜牛奶(伊利,内蒙古伊利公司);其它试 剂均为分析纯;水为二次去离子水. 1.2实验方法 取一定量的BSA标准溶液于25mL容量瓶中, 依次准确加入7mL1.14×10mol/LBCG和3mL pH3.3的Britton—Robinson缓冲溶液,以水定容,静 置12min.以相应的试剂空白为参比,在室温下用 1ClTI比色皿在波长628Bin处测定其△4. 2结果与讨论 2.1吸收光谱 BCG与BSA形成的复合物的吸收光谱(见 图1).在pH3.3时,试剂BCG本身的吸收峰在 444llll”l处.而从BCG-BSA吸收光谱中得知,随着 BSA的浓度增大,图中444nIn处的吸收峰不断下 降,并蓝移至416nm;而618DAB吸收峰升高并红 移至628nln.由于受BSA微环境的影响,BCG分 子巾具有疏水性质的苯环通过疏水相互作用与 BSA分子疏水空腔结合,使BCG与BSA生成了复 合物l5.实验采用的测定波长为628nm. 收稿日期:2008—08—1l;修订13期:2008—10—24 作者简介:严志红(1977一),男,讲师;E-mail:yzhxsp@yahoo.coin.cn 一 82— 第28卷第9期 2009年9月 分析试验室 ChineseJournalofAnalysisLaboratory Vo1.28.No.9 20o9—9 |/nm 图1复合物在不同浓度的BSA存在时的吸收光谱 FiglUV-Visspectraofthecomplexinthepresenceofdif- ferentconcentrationsofBSA CB(=3.2×10～mol/L,pH3.3 曲线1～4:cBsA=0,2,20,200~g/mL 2.2pH对结合反应的影响 溶液的酸度是影响BSA与BCG结合反应的重 要因素.实验考察了不同缓冲体系:B—R,Tris. HC1,HAC—NaAc,NH3H2O-NH,C1,Na2HPO4一 №H2PO4等缓冲体系对结合反应的影响.结果发 现:在B—R缓冲溶液中pH3.2～3.5之间的吸光度 最大且保持基本不变.实验采用B—R缓冲溶液 (pH3.3)为底液. 2.3BCG的用量 固定BSA为200~g/mL.通过改变试剂BCG的 用量,以对应试剂空白为参比,考察了BCG用量 对该结合反应的影响.结果表明:随着BCG用量 的增大,该体系的吸光度逐渐增大,当用量在6.5 8.0mL,浓度为1.14X10mol/LBCG时体系的 吸光度较大且基