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反胶束萃取技术分离胰激肽原酶 中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2007,27(3):93～99 反胶束萃取技术分离胰激肽原酶 王金枝曹学君 (华东理工大学生物反应器7-程国家重点实验室生物7-程系上海200237) 摘要研究了用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)/正己醇/正辛烷反胶束溶液萃取和反萃取商业 用胰激肽原酶时,水相pH值,离子强度和种类,CTAB浓度和助表面活性剂浓度等因素对分离效 率的影响,并从反胶束微观结构给予解释.结果表明:[CTAB]=0.02mol/L,正己醇/正辛烷(V/ V)=1:5,萃取pH=9.0,反萃pH=7.0,萃取[KBr]=0.1mol/L,反萃[KBr]=1.5mol/L,反萃取 加15%乙醇(v/V)时,萃取率接近100%,反萃取活性回收得率在80%以上.商业用酶的纯化倍 数最高为1.97倍,粗酶为7.15倍,且粗酶纯化后比活在200U/mg以上,电泳分析证实了纯化效 果,显示了很好的工业前景. 关键词胰激肽原酶反胶束萃取反萃取CTAB 中图分类号Q814.1 猪胰脏粗制品材料中主要含有胰蛋白酶,糜蛋白 酶,胰淀粉酶,胰脂肪酶,胰激肽原酶,弹性蛋白酶和羧 肽酶等.胰酶在临床上主要作为助消化药.而其中的 胰激肽原酶(Kallikrein)为周围血管扩张药.有改善微 循环作用,用于糖尿病引起的微循环障碍及其他闭塞 性周围血管病,具有很高的药用价值….胰激肽原酶 为类白色或淡褐色粉末.无臭,易溶于水.等电点为 4,8,分子量为30000左右. 反胶束萃取技术是近年来发展起来的一种新型分 离技术[2,3l.反胶束是溶解在有机溶剂中的表面活性 剂自发形成的纳米级的一种聚集体.在反胶束溶液 中,组成反胶束的表面活性剂,它的非极性尾向外伸人 非极性有机溶剂主体中,而极性头则向内排列形成一 个极性核(p0larcore).此极性核具有溶解水和大分子 (如蛋白质)的能力.当含反胶束的有机溶剂和蛋白质 水溶液接触时,蛋白质在某种作用力(静电,亲和,疏 水)下进入极性核中,然后再调节适当的条件,使蛋白 质从负载有机相重新反萃取到水相中,以达到纯化的 目的. 反胶束萃取的实质是溶剂萃取,因而具有样品处 收稿日期:2006.10-23修回日期:2007-01-04 ?通讯作者,电子信箱:caoxj@oouat.edu.ca 理量大,容易放大和可连续操作的特点,且反胶束内的 环境接近细胞内的环境,蛋白质不易变性.反胶束体 系特别适用于生物产品的初级分离;与其他方法(如超 离心,凝胶过滤层析,亲和技术等)结合使用,还可用于 生物产品的纯化. 目前胰激肽原酶的制备方法多采用盐析沉淀,凝 胶过滤层析,离子交换层析,疏水作用层析,亲和层析 等j.这些方法存在操作时间长,不易放大的缺点. 本文尝试采用反胶束相转移法萃取和反萃取胰激肽原 酶,取得了较好的效果.该分离技术用于胰激肽原酶 的分离纯化还未见报道. 1材料与方法 1.1材料 十六烷基三甲基溴化铵CTAB,上海凌峰化学试剂 有限公司生产,分析纯;商业用胰激肽原酶,北京东凯 元医药生物技术研究院生产,分子量30000,pI4.8,生 化试剂;胰酶粗提物,江苏省常熟市蓝天化学生化厂提 供;N一苯甲酰一L一精氨酸乙酯BAEE,上海饶纳生物技术 有限公司,分析纯;考马斯亮蓝G250,Fluka进口分装, 分析纯;丙烯酰胺,分析纯,上海源聚生物科技有限公 司;正辛烷,正己醇,甲醇,B-巯基乙醇等试剂均为市售 分析纯. 94中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo1.27No.32007 1.2方法 1.2.1胰酶粗品的制备将冰冻猪胰脏或新鲜胰脏 用绞肉机绞碎,加辅料,在一定温度和pH下进行搅拌 激活.将激活的胰浆过滤,滤液用乙醇沉淀.将沉淀 压榨,脱脂,干燥,磨粉,制粒,得到胰酶粗粉J. 1.2.2溶液配置称取CTAB溶解于1:5的正辛烷和 正己醇混合液中,配成20mmol/L的无色透明溶液.称 取粗酶2.5g溶解于前萃取水相缓冲溶液lOOml,磁力 搅拌30min,在4~C,10000r/min离心30min,取上清液. 商业酶则直接配成1mg/ml的酶溶液. 1.2.3萃取与反萃取室温下,取含胰激肽原酶的水 溶液2ml和等体积的反胶束溶液置于具塞试管中,漩 涡混合2min直至达到萃取平衡,使胰激肽原酶充分转 移至反胶束中,静置分相,测定水相中蛋白质含量及酶 的活性,计算萃取收率.取萃取分相后的有机相1.5ml 和等体积的缓冲液混合,加入乙醇,漩涡混合,静置至 分相.测定水相中的蛋白质含量和酶的活性,计算反 萃取收率. 1.2.4胰激肽原酶的测定与电泳水相中酶含量的 测定采用考马斯亮蓝G-250染色分析法.酶活性的测 定采用分光光度法(中国药