检本 PCR术及其应用.ppt

PCR及其相关技术 第一节 聚合酶链式反应 PCR 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction) 一、PCR的反应过程 1.在体外如何使模板DNA的双链解开，提供单链做为模板呢？ 2.在体外如何使引物与模板结合，以催化新的子链的不断延伸？ 添加剂 加入适量二甲基亚砜或甲酰胺 破坏模板的二级结构，利于解链 加入BSA或DTT 增加或改进DNA聚合酶的稳定性。 1.反应温度 变性温度：94℃～97℃ 退火温度：引物Tm －5℃左右 温度过高：降低扩增效率 温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：72℃ 2.反应时间 第一次变性应给予足够时间（5～7分钟） 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30s～1min时间过长易导致非特异性扩增 三、PCR的反应条件 平台出现的迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早 平台效应产生的因素： 引物二聚体的产生 反应体系各组分的消耗 引物和已扩增的DNA片段间的竞争等 五、PCR技术的质量控制 1.实验室的规范化设置 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 2 .PCR技术的质量保证 分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理 分析中因素：避免污染，保证质量 分析后因素：报告形式、反馈的信息等 五、PCR技术的质量控制 防污染体系： 提取模板DNA时避免交叉污染 所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，用后作一次性处理，避免反复使用造成污染 PCR操作应戴手套并勤于更换 试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会 五、PCR技术的质量控制 防污染体系： 反应体系中以dUTP取代dTTP，加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），破坏以往的扩增产物 每次实验完毕后须用1g/L次氯酸钠清洁实验台面，或用254nm波长的紫外光近距离充分照射 第二节 以PCR为基础的相关技术 逆转录合成cDNA所用的引物： 以PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物 以oligo(dT)作为引物 以人工合成的随机序列（六核苷酸混合物）作为引物 相对定量PCR的优势与不足 不需要特殊的检测设备和试剂即可以对靶基因进行相对定量。 内对照系统无法排除参照基因本身表达变化的影响及参照基因和靶基因两者扩增效率不同等因素对实验结果的干扰。 必需确定反应不处于平台期。 劳动强度大，定量不准确 荧光信号的检测方法 5700 7700 （1）定量PCR的外参照系统 标准曲线的制备 1.制备标准品并计算标准品浓度 2.系列稀释的标准品与被检样本分管扩增，同时检测 3.仪器软件绘制标准曲线并依据被检样品 的Ct值给出每一反应中靶基因的拷数。 优点：避免了由于不同抽提效率导致的样本间的差异 缺点：仍不能监控内标准品和靶基因是否有一致的扩增效率 （一）引入点突变 （二）引入片段性缺失 第三节 PCR产物检测 一、PCR-RFLP 利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。 应用： 1 2 3 4 5 6 7 8 HbA: N’ Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys HbS: N’ Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys HbA基因: －－－－－－ CCT GAG GAG － HbS基因: －－－－－－ CCT GTG GAG － 二、ASO技术 受检者基因组DNA或含 突变位点的PCR扩增产物 与标记的ASO 探针杂交 二、ASO技术 镰状细胞贫血： GAG(Glu)--GTG(Val)? bA probe ACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC bS probe ACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC? 二、ASO技术 Reverse Dot Hybridization，RDH 如果同一种疾病有多种突变类型，则可将相应于各种突变的不同ASO探针点膜，然后与标记的受检DNA杂交，称为反向斑点印迹