江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子基因的克隆及测序.docVIP

江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子基因的克隆及测序 第3O卷第1期 2003年1月 浙江大学(理学版) JournalofZhejiangUniversity(ScienceEdition) 江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子 基因的克隆及测序 王云贵,林茂芳,瞿国伟,叶绣锦,何静松 (浙江大学医学院附属第一医院血液病研究所,浙江杭州310003) 摘要:从江浙蝮蛇毒腺中抽提总RNA,RT—PCR进行体外扩增,获得江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子基因,克隆至 pGEX一5X一3载体中.对3个重组克隆分别作DNA全序列分析,通过遗传密码推导出相应的氨基酸序列.与其它已 知的丝氨酸蛋白酶型蛇毒蛋白的氨基酸作比较,其中许多位置上氨基酸有很强的同源性.该基因的成功克隆,不仅 推导出江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子的蛋白质序列,也为进一步开展江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子蛋白质工程的 研究工作打下良好的基础. 关键词:江浙蝮蛇;蛋白C激活因子;基因;克隆l序列分析 中图分类号:Q785文献标识码:A文章编号:1008—9497(2003)01—079—04 WANGYun—gui,LINMao—fang,QUGuo—wei,YEXiu—jing,HEJing—song(InstituteofHematology,Medical College,ZhOiangUniversity,Hangzhou310003,China) CloningandsequencingofproteinCactivatorgenefromAgkistrodonblomhoffiibrevicaudus.JournalofZhejiang University(ScienceEdition),2003,30(1):79～82 Abstract:TotalRNAwasextractedfromtheglandofthesnakeAgkistrodonblomhoffiibrevicaudus.Theprotein CactivatorgenethenwasamplifiedbyRT—PCRandclonedintothepGEX一5x一3vector.Itsnucleotidesequence wasdeterminedbyanalyzingthefullDNAsequenceofthreecoloniescontainingtheproteinCactivatorgene.The deducedgeneaminoacidsequenceisanalogoustOotherserineproteasesfromsnakes.Thesuccessfulcloningofthe proteinCactivatorgenenotonlymadethedeterminationofitstotalaminoacidsequencepossible,butalsoprovid— edagoodbasisforfurtherresearchworkintheproteinengineeringofproteinCactivatorfromsnakes. Keywords:Agkistrodonblomhoffiibrevicaudus;proteinCactivator;gene;clone;structureanalysis 蛇毒对人体凝血功能的损害,是蛇伤致病中病 理学基础之一.尤其是血循环毒为主的蝰科毒蛇(如 江浙蝮蛇)蛇毒,通过改变人血浆凝血因子的活性, 使血液呈现异常高凝或低凝状态,产生临床病理性 改变,严重时则导致病人死亡.一些蝮蛇蛇毒中存在 能够激活人血浆蛋白C的激活蛋白,称之为蝮蛇蛋 白C激活因子,约为2.5～4.0KD的中等分子量, 具有丝氨酸活性中心.蛇毒蛋白C激活因子通过裂 解蛋白C重链N端一段小肽段后使人血浆蛋白C 活化.动物试验显示,深部静脉血栓,心绞痛,心肌梗 塞和缺血性脑梗塞等临床血栓性疾病的发生发展, 与血浆蛋白C含量和活性的改变密切相关,因此蛇 毒蛋白C激活因子作为一种新型的抗凝蛋白,为血 栓性疾病基础理论研究和临床防治技术的进一步展 开提供了一个新的研究途径,具有潜在的临床治疗 价值口].因此作者设想克隆蛇毒蛋白C激活因子 基因,为高效表达具有生物活性的蛇毒蛋白C激活 因子打下基础,并期待应用于临床. 1材料和方法 1.1材料 宿主菌E.coliTG一1由本实验室保存,质粒 pGEX一5X一3购自PharmaciaBiotech公司.抽提 收稿日期:2001—02—27. 基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(No.397442). 作者简介:王云贵(1973一),男,硕士,主要从事分子生物学及血液病基础研究工作 80浙江大学(理学版)第30卷 RNA的试剂Trizon及