Westen Blot共聚焦.pptVIP

严 明 2013-8-26 实验目的 检测细胞或组织蛋白中目标蛋白质的表达 表达定位：组织（细胞）免疫荧光 激光共聚焦 表达定量：western blot Western blot技术 原理 免疫印迹（Western blotting ） 应用蛋白质特异的单克隆抗体或多克隆抗体检测特异性的目的蛋白 未知蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶单向电泳（SDS） 转移到固相支持物 特异性的抗体检测目的蛋白 原理 SDS原理 适用范围和条件 检测细胞或组织内目的蛋白质的表达 检测细菌、真菌、血清等目的蛋白的表达 非原位检测，不能对目的蛋白做细胞定位 必须有目的蛋白质的特异性抗体才能完成检测 属于半定量检测，需以内参蛋白，如β-肌动蛋白（β –actin）， GAPDH等作为对照 操作流程 总蛋白抽提 完全性 防降解 保活性 蛋白浓度测定 Bradford比色法 测定考马斯亮兰与待测蛋白的结合量 用已知浓度的标准蛋白质（如牛血清白蛋白BSA)制作标准曲线 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 一维分离 分子量不同,与电荷无关 凝胶制备 分离胶-积层胶 蛋白前处理 蛋白变性 垂直电泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 -凝胶制备 根据目的蛋白的分子量及SDS-聚丙烯