免疫细胞分离与检测 - 第二十二章免疫细胞的分离与检测（ Separate and.pptVIP

免疫细胞的分离与检测 信阳职业技术学院 药学与检验系 免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，主要包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、树突状细胞、各种粒细胞、红细胞和肥大细胞等。 根据各类免疫细胞独特的表面标志及其特殊功能。用体外或体内方法将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来，对其进行数量和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段,也是细胞生物学、免疫学中进行细胞分离、培养和建立细胞株等研究的重要基本技术之一。 第一节 免疫细胞的分离与纯化 白细胞的分离 外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞的纯化与亚群分离 吞噬细胞的分离 白细胞的分离 血中红细胞和白细胞的比例约为600～1000:1，两类细胞密度不同，其沉降速度各异，通常用以下两种方法分离。 1．自然沉降法 是利用血细胞自然沉降率的分离方法。 采集外周静脉血，肝素抗凝，将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min后，由于红细胞沉降速率较快，可使白细胞与之分离。上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞。吸取富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 2．聚合物加速沉降法 某些高分子聚合物如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等可使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。 此法白细胞获得率比自然沉降法高，但其中的明胶法可使白细胞粘性增加，对实验产生一定影响。 二、外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。 PBMC的密度与血液中的其他成分不同。 血小板的密度为1.030～1.035， 粒细胞为1.092， 红细胞为1.093， 淋巴细胞和单核细胞的密度为1.075～1.090。 利用一种密度介于1.075～1.092之间、近于等渗的溶液(分层液)进行密度梯度离心，可使不同类别的血细胞按其相应密度分布，从而被分离。 常用的分层液有聚蔗糖-泛影葡胺分层液法和Percoll分层液法两种。 (一)聚蔗糖-泛影葡胺分层液法 聚蔗糖-泛影葡胺分层液法是分离PBMC一种单次密度梯度离心分离法。 二、淋巴细胞的纯化与亚群分离 PBMC悬液主要含淋巴细胞，但一般还混杂有数量不等的单核细胞及少量粒细胞、红细胞和血小板。 为获得高纯度的淋巴细胞或其亚群，可采用如下分离去除方法。 (一)红细胞的去除 一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。 (二)血小板的去除 将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。 在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板 。 (三)单核细胞和粒细胞的去除 1．粘附去除法 单核细胞和粒细胞具有粘附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶的特性，通过PBMC与玻璃或塑料平皿的粘附作用，采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。亦可应用玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G-10柱，清除粘附的细胞，洗脱液中主要是淋巴细胞。此法简便易行，对细胞损伤极少，缺点是B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。 2．羰基铁粉吞噬法 单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大，再经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。也可在单核细胞悬液内加入羰基铁粉颗粒，待单核细胞充分吞噬羰基铁粉后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。 3．苯丙氨酸甲酯去除法 苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶解。用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。该法去除单核细胞后，约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。 (四)淋巴细胞亚群的分离 淋巴细胞是复杂的不均一的细胞群体，它包括了许多形态相似而表面标志和功能各异的细胞群和亚群。根据细胞的表面标志和功能等不同，借助多种方法分离淋巴细胞亚群。 1．E花环分离法 成熟的T细胞表面表达绵羊红细胞(SRBC)受体，即E受体。T细胞能与SRBC结合形成E花环，而B细胞则不能。 该方法简便易行，所获细胞的纯度可达95%～99%，可同时获得B细胞。缺点是E花环形成后可能使T细胞活化。 2．尼龙棉柱分离法 将淋巴细胞悬液加