医学ppt课件1991年诺贝尔生理医学奖膜片钳技术.ppt

1991年诺贝尔生理医学奖;Neher出生于1944年，德国人1965年毕业于Wisconsin University1976年在耶鲁大学医学院取得医学博士学位此后长期从事基础医学研究 ; 1976年Neher和Sakmann建立了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术。以后由于吉欧姆阻抗封接（109Ω）方法的确立和几种方法的创建，1980年以来，此技术已可用于很多细胞系的研究。;膜片钳技术的优势在于其具有0.06pA的电流测量灵敏度，1μm2的空间分辨率及10μS的时间分辨率。使我们通过该技术了解到某个瞬间、特定条件，细胞膜离子通透性和膜通道蛋白构型的变化，从而使其成为目前从功能角度探讨各种生理、病理功能机制的最直接、理想的电生理学研究手段。该技术的问世，为生理学、药理学、病理生理学和分子生物学的多种学科关于生命活动规律、疾病及转归机制、药物作用机制的研究开辟了广阔的前景。Neher和Sakmann也因其杰出的工作和贡献，获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。;在兴奋过程中离子移动数量之多，速度之快，使人们推测在兴奋时膜结构中有特殊的蛋白质通道的存在。但由于当时技术所限，未能阐明。直至1976年Neher和Sakmann首次运用一种被称为膜片钳(patch clamp)的新记录方法，记录膜结构中单一的离子通道的开放和关闭，引起的单通道离子电流和电导，从而揭开了离子通道研究的新篇章。; Neher和Sakmann将直径1~5μm的玻璃微电极在火上抛光，然后与经蛋白酶处理清洁的细胞表面紧密接触。电极尖端与膜之间的接触，使尖端内的小片膜与其余部位在电学上绝缘，形成50MΩ封接，保证了电流经微电极进入测量电路。以后，Neher又作了改进，用负压轻吸微电极造成管口与膜脂质双层之间非常紧密的封接（千兆欧封接）。千兆欧封接有两个重要后果，首先，小管内和细胞外液之间的电阻高达100千兆欧姆，因此在同一钳位电压下，膜单离子通道开放和关闭引起的离子电流、电导以及通道开放的时间机率及通道的动力学特性等皆可被测定。;第二，微电极尖端管口和膜之间封接的机械强度不同，可以产生几种不同的记录方式。不同??记录方式可用来研究通透性的不同方面。微电极尖端管口所围绕的细胞膜就是要观察离子通道变化的“膜片”，如果在这一小片膜上只含有一个或少数几个通道蛋白分子，则可通过离子通道电导的特点，测定出单一通道开放时的离子电流，从而对单通道的功能特性进行分析。他们应用这套技术顺利地记录了蛙肌肉细胞上单一离子通道电流。结果显示，蛙肌肉细胞的细胞膜上一个离子通道可通过的电流约为20×10-12A，换成离子数目大约是每秒通过一亿个离子。此后，他们又对离子通道的运作，细胞分泌过程及通道的调节功能进行了研究。;A显示出玻璃微电极接触进入至细胞中。B则是使用高级放大仪，将膜上的离子通道与微量吸管的尖端相触，以放大一部分的细胞膜。其中，微量吸管内连接了电流放大器。D表示电流通过离子通道，离子通道开启。C为通道的高度放大：细胞外覆有受体以及离子滤器。;;细胞膜电流的测定; 膜片钳技术是用玻璃微电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行监测记录的方法。;膜片钳技术原理图 ;Faraday cage;Micro-Manipulators;Patch clamp; 首先建立的单通道记录法（single channel recording）是细胞吸附式（cell-attached mode），其后又建立了膜内面向外模式（inside-out）和膜外面向外（outside-out）的模式。后来，又分别建立了开放细胞吸附内面向外模式（open cell-attached inside-out mode）和穿孔囊泡外面向外模式（perforated cell-attached inside-out mode）。全细胞记录法是指在常规的方法的基础上，附加穿孔膜片（perforated patch）的模式。;膜片钳法的各种模式图;膜片钳技术的最主要的优点在于阻抗封接形成的结果使漏出电流极少，所以能正确地进行电压固定。然而不足的是，在形成巨阻抗封接时，由于腔内负压的作用使膜片被吸入微电极腔内，形成所谓的“Ω”形膜片，从而造成不可避免的机械性刺激。 由巨阻抗封接带来的第二大优点是背底噪声水平达到极低。因为由热噪声引起漂移的标准误差与阻抗的平方根值成正比，所以巨阻抗封接是可达到最小。此外，虽然所用的膜片钳放大器