蛋白质的生物质谱分析并分析.pdf

● 摘要蛋白质的生物质谱分析 蛋白质的生物质谱分析 摘 要 f ● f自从90年代初，电喷雾、基质辅助激光解析等新型的离子化技术出现后， 用质谱分析鉴定大分子蛋白质成为常规分析手段。相比传统的蛋白质分析技术， 质谱以其快速、灵敏、提供信息丰富等特点，成为生物学和化学工作者的有力工 具。质谱能够精确地测定蛋白质等大分子的分子量，因此可以快速、有效地鉴定 基因表达的蛋白质，与HPLC、CE、分离芯片等联用后，可以推测蛋白质的～级 ● 结构， 并发现基因在表达过程中的修饰和变异。随着人类基因组测序的基本完 成，蛋白质组学成为新的研究热点。生物质谱技术以其独有的优势又成为蛋白质 组学研究中的核心技术。目前，用二维凝胶电泳和质谱开展功能蛋白质组的研究， 对发现致病基因、新药开发具有指导性作用；从发展前景上看，质谱可以大规模、 高效率、高准确性地鉴定一个组织或细胞中的全部蛋白质，对于在细胞和生命有 机体的整体水平上认识生命现象的本质和活动规律具有深远的意义。 ● 目前，用生物质谱分析鉴定蛋白质的方法学仍在不断发展，发展有效的联用 技术，样品的前处理，谱图中大量有用信息的提取和解析，数据库搜索方法的优 化和改进，对最后快速、有效地鉴定蛋白质部具有重要的作用。对新兴的蛋白质 组学来说，研究体系更为复杂，极微量蛋白的有效分离、提取和鉴定方法都还没 有很成熟的规律，都是难点ij趣和关键技术。对上述问题进行探索性研究，具有 ● 深刻的学术与应用意义。矿 本论文主要发展了前人创立的用电喷雾质谱分析鉴定蛋白质的标准方法；在 蛋白质组学研究中，创建了鉴定胶上染色斑点的标准方法，并应用于二维凝胶电 泳分离后胶上实际斑点的鉴定。 在此过程中，研究和讨论了样品前处理技术，证明样品脱盐和去除表面活性 剂的必要性，并在以后的分析实践中使用最有效的HPLC--MS联用技术进行在 线的前处理、分离和检测。I在微柱HPLC一质谱联用技术方面，优化了各种仪器 条件，进一步提高了质谱的检测灵敏度，减少了柱后扩散效应，并得到断裂更完 全、可推测序列更长的CID谱图。在蛋白质组学的蛋白鉴定方面，建立了～套 胶上酶解、肽段提取、微柱HPLC—MS联用分析、数据库搜索的有效方法。在 胶上极微量蛋白点的检测方面，有效地应用自填毛细管柱和质谱联用，初步分析 ● 了胶上极微量的结核杆菌分泌蛋白点。1／ 在复杂的CID谱图解析方面，综合应用并讨论了Derlovo测序方法和本实验 室发展的序列模式相关的测序方法，有效地应用于谱图解析和数据库搜索。在数 据库搜索方面，成功地应用并讨论了多种数据库搜索方法，如肽质量指纹搜索， 用解谱后的序列搜索，序列标签搜索，并发展了一种更为有效的数据库搜索方法， ● 即使用MAscOT搜索平台，不用解谱，直接将多组CID谱图碎片数据输入数据 库，进行批处理搜索。通过大量的比较研究证实，综合运用多种数据库搜索方法， ■ 摘要蛋白质的生物质谱分析 、／ 都能获得确定的结果。其中，最简便、确定性最高的是MASCOT批处理搜索。， 最后，本论文研究和讨论了热变性对蛋白的结构影响及对酶解效率的影响。 比较研究了牛血清白蛋白、溶菌酶、肌