实验八聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳ppt课件.pptVIP

行业处理客户投诉的技巧课件神经内科医疗质量及管理规范神经疾病病情观察及能力培养社区老年痴呆的全科诊疗身边的侵害和保护少先队礼仪文化知识培训 实验八 聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳 目的与要求 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质的原理； 熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法和操作技术。 实验原理 电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。 电泳技术根据支持物的不同可分为：纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 经凝胶形状分：水平平板电泳、圆盘柱状电泳及垂直平板电泳。 水平板式电泳槽 垂直板式电泳槽 柱状电泳槽 电泳分离原理 在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。 F＝QE 质点的前移同样要受到阻力（ F′）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即： F′＝6πrην 式中r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时： F＝F′即QE＝6πrην v = QE 6πrη 聚合反应是由溶于水的AP产生自由基S2O8-→SO4-自由基SO4-，催化TEMED使之成为带不成对电子的活化分子，活化的TEMED可随机与Acr分子或Bis分子结合并转移自由基使之活化。被活化的Acr可以同样的方式结合另一分子Acr并转移自由基使其活化，如果反应物中只有Acr分子，按反应机理可以使所有Acr分子结合成长链，使其末端的Acr分子始终带有被转移的自由基活性，但仅Acr分子的多聚体只能形成长链，尽管呈黏稠状，但不能形成带孔的凝胶。 Bis是由两个Acr分子靠甲叉基相互连接构成。Bis中的两个丙烯酰胺都可以分别被TEMED活化成为活化分子，而后又去不断地结合和活化其他Acr分子，形成长链；或者分别被已形成长链的Acr活化连接；或者一边被TEMED活化后与Acr形成长链，另一边与已合成的Acr长链结合等，其反应是随机的，多样的，但无论如何反应，在形成的Acr长链之间由于Bis的纵链而被连接起来，形成立体的网状结构。Bis是一种引入纵链的交联剂。这样，按一定比例的Acr和Bis在TEMED、AP的作用下就形成具有立体多孔、多分枝网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。 丙烯酰胺（Acr） 交联剂: 甲叉双丙烯酰胺（Bis）催化剂: 过硫酸铵（化学法） 核黄素 (光化法） 活化剂: TEMED （N，N，N’，N’-四甲基乙二胺) C 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 系统的不连续性表现在以下几个方面： 1. 凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 2. 缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3. 在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。 8.3 6.7 8.9 8.3 浓缩效应 样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。当通电后，样品进入浓缩胶中，解离度最大的cl-—有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=5.97)泳动速度最慢，被称为慢离子。由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。电导与电势梯度成反比，因而在快、慢离子间形成了局部较高的电位梯度。处于该高电位梯度下的血清蛋白质各成分以不同速度（分子量和带电量不同）泳向快离子区，后又急速减慢，因而就按其分子的大小堆积浓缩成层。 电荷效应 当各种离子进入pH8.9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快赶上蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。 分子筛效应 由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，故因迁移率不同而被分离。此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种:化学聚合（AP）；光聚合（核黄素）用核黄素进行光聚合的优点是:①核黄素的用量很低；②通过光照可以预定聚合时间。 但光聚合的凝胶孔较大,而且随时间延