免疫组化小结13年ppt课件.pptVIP

免疫组织化学技术方法小结 倪灿荣 一、免疫组织化学根据示踪物不同，可构成不同的免疫组化方法 1.荧光素----免疫荧光组化技术 直接法 间接法 LsAB法 2.酶(HRP-AKP)-----免疫酶组化技术 直接法、间接法、桥法、PAP法、双PAP法、APAAP法、Epos法、EnVision法、UIP法、PicTureTMplus法、ABC法、S-P法 3.金—IGSS、IGS 直接法 组织抗原 第一抗原 第二抗体 过氧化物酶 间接法 酶桥法 组织抗原 第一抗体 第二抗体 第三抗体（抗酶抗体） HRP 组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 PAP法 HRP 多聚螯和物酶法 Epos法 • EnVision法 • UIP法 组织抗原 一抗 HRP 多聚骨架 EPOS 方法 组织抗原 一抗 二抗 酶 多聚骨架 第一步 第二步 EnVisionTM方法 3.亲和细胞化学方法----生物素和卵白素 ABC法、LsAB法(S-P法)、CSA法 组织抗原 第一抗体 第二抗体 HRP 生物素 卵白素 ABC法 LSAB法 ABC法与S-P法的特点和区别点 特点 1.均为亲和细胞化学方法； 2.生物素化二抗与特异性一抗结合； 3.亲和素(Avidin)与生物素(Boitin)结合； 4.亲和素与链霉亲和素(Streptavidin)均有四个结合位点,其中三个位点与酶(HRP和AKP)结合,一个位点与生物素结合。 ABC法与S-P法的特点和区别点 区别点 1. ABC(SABC)法将酶标记在生物素(Bi-HRP)上,而S-P法将酶直接标记在链霉亲和素上(四个位点中的三个标记上酶分子)； 2.应用时ABC法应在30min前将avidin与bio-HRP等量混合，而S-P法不需耍。 问题 1.免疫组化直接法、间接法、桥法与PAP法的共同点和不同点？ 2.PAP法、ABC法、EnVision法的共同点和不同点？ 3.免疫荧光组化法、免疫酶组化法和免疫金银组化方法间的共同点和不同点？ 4.PAP法、ABC法、EnVision法和IGSS法的共同点和不同点？ 5.S-P法与CSA法的共同点和不同点？ CSA法原理图 4.金-------免疫胶体金法 IGS法、IGSS法 5.铁-------免疫胶体铁法 二、与其他技术相结合的免疫组化方法 RCA法 PCR-免疫组化方法 滚动式循环放大（Rolling Circle Amplification）法 RCA是一种能够在恒温条件下，使标记在抗体上的寡核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，加入互补并标记有示踪物的寡核苷酸，随着扩增循环的进行，将大量的示踪物沉淀在抗原抗体复合物的周围，或杂交分子周围，再通过IHC方法再放大示踪物。 原位免疫PCR Sano等（1992）率先利用基因工程的方法表达了蛋白A与链霉亲和素的嵌合体分子获得成功，建立了免疫PCR技术,一种新的抗原检测系统，随后在免疫PCR的基础上，建立了在细胞或组织原位检测抗原的原位免疫PCR（in situ immuno-PCR）。 HRP呈色反应原理 HRP+H2O2 HRP.H2O2+供氢体(电子供体) HRP+H2O+供氢体(氧化型) 氧化、环化 吲哚胺多聚体 苯乙肼聚合体 氧化、环化 HRP特异底物为H2O2 ，在分解H2O2过程中，与H2O2形成初级复合物，无电子供体时，反应不再继续进行，当电子供体存在时，反应以一定的速度形成第二种复合物。 之后HRP催化H2O2已形成的中间型产物，迅速生成水，酶被还原，电子供体被氧化、聚合，再经氧化环化，最后形成吲哚胺多聚体，此多聚体进一步氧化、环化，形成苯乙肼聚合体，如供氢体是DAB，产物为棕