T-A基因克隆的技术要点.ppt.pptVIP

主要内容 （一）重组T质粒的构建 （二）重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定 1. 大肠杆菌感受态细胞的制备 2. 重组DNA的转化 3. 重组质粒的鉴定 3’-A突出的PCR产物 使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A 。 使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，其不能在扩增产物的3末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟。 T载体 一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，再在70℃或72℃下在只加入dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。 如果使用ddTTP，效果会更好。 T载体 pMD 18-T Vector 是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning)的专用载体。 它由pUC18载体改建而成。在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I 和Sal I识别位点之间插入了EcoR V 识别位点，用 EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3‘端添加“T”而成。 pUCm-T 由pUC-19改建而成。 pUC18载体 pMD18-T Vector pUCm-T pUCm-T的多克隆位点 PCR克隆目的基因的基本程序 大肠杆菌感受态细胞的制备 原理 受体细胞经过一些特殊方法（如CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许许多外源DNA的载体分子通过的感受态细胞（competent cell）。 大肠杆菌感受态细胞的制备 操作方法 1）取1支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2mL LB（不含抗生素）培养基。 2）从超低温冰柜中取出DH5α菌种，取2μL菌液接入含2mL LB 培养基的试管中，37?C摇床培养过夜。 3）次日取0.5mL上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37?C下250r/min摇床培养2~3h，测定A590为0.375 （0.4，细胞数108/mL，此为关键参数）。 以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。 4）将菌液分装到1.5mL预冷无菌的Ep管中，于冰上放置 10min，然后于4 ?C下5000r/min离心10min。 大肠杆菌感受态细胞的制备 操作方法 5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1mL冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液，立即在快速混匀器上混匀，插入冰中放置 30min。 6）4 ?C下5000r/min离心10min，弃上清液后，用1mL冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬，插入冰中放置30min。 7）4 ?C下5000r/min离心10min，弃上清液后，用200μL冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬菌液，超净工作台中按每管100μL分装到1.5mL离心管中。可以直接用做转化实验，或立即放入 -80?C超低温冰柜中保藏（可存放数月）。 8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。 外源DNA的重组与转化 DNA的体外连接重组 其本质是一个酶促反应过程，即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5’端磷酸和3’端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。 DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶。 其中T4 DNA连接酶对作用底物要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应用更为广泛。 外源DNA的重组与转化 T4 DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步： 首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP通过T4 DNA 连接酶中亮氨酸的氨基与ATP中的磷酸作用形成酶-ATP复合物； 然后，酶-ATP复合物活化DNA的5’端的磷酸集团，通过磷酸-磷酸键结合到 DNA分子上，使DNA腺苷酸化； 最后，DNA链3’端的羟基活化，取代ATP后与DNA链5’端的磷酸根形成磷酸二酯键，释放出AMP，完成DNA的连接。 外源DNA的重组与转化 转化 是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 原理 细菌处于0?C时，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42?C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得