海参钙离子通道基因的克隆与性质分析.ppt

研究生：杨冠科 指导教师：丛丽娜 教授 海参（Sea Cucumber） 海参自溶现象，困扰生产商多年 养殖过程中遇到的诸多问题，持续出现 传统的理论解释和研究方法不能满足生产和科研的需要。 关键问题-------海洋的高盐浓度及高压环境 盐离子浓度 离子通道 离子通道（Ion Channel） 钙离子通道 本文用分子生物学手段对海参体内的钙离子通道β亚基基因进行了研究 用生物信息学手段对所得到的该基因全序列进行了性质分析 论文的主要工作内容 总RNA的提取 利用设计的简并引物进行RT-PCR 设计引物，进行3 RACE PCR 设计引物，进行5 RACE PCR 拼接全序列并进行生物信息学分析 总RNA的提取 TRIzol法 RT-PCR简并引物的设计 为了设计简并引物，我们比对了如下物种钙离子通道β亚基的氨基酸序列： 合浦珠母贝(Pinctada fucata, GenBank accession number: EF154452) 紫色球海胆（Strongylocentrotus purpuratus, GenBank accession number: XM_785360） 锥实螺(Lymnaea stagnalis, GenBank accession number: AF484087) 人(Homo sapiens, GenBank accession number: BC075049) 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, GenBank accession number: AF000198) 牛（Bos Taurus, GenBank accession number: AF174417） 曼森血吸虫(Schistosoma mansoni, GenBank accession number: AY277532) 最终引物 HS4-1: 5′-ARYAATGAYTGGTGGAT-3′ HS4-2: 5′-GCYTTYTGCATCATRTCT-3′ 注：R=A/G Y=C/T RT-PCR结果 二次PCR结果 RT-PCR割胶回收及菌落PCR结果 SjCaβ保守区测序结果 SjCaβ保守区的BLASTX 长度为443 bp的产物 3′ RACE 引物设计 3′ RACE Outer Primer : 5′- TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′ HS4-1-GSP1(Outer Primer) : 5′-TTCACCCTGGCTAACTCACG-3′ 3′ RACE Inner Primer : 5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’ HS4-1-GSP2(Inner Primer) : 5′-GAATCGCTACGGAGAACGAAAAGTG-3′ 3 RACE PCR结果 3’RACE 割胶回收及菌落PCR结果 SjCaβ 3 RACE测序结果 序列长为1019 bp 经过序列比对得到此序列的5′ 端与SjCaβ序列保守区的3′ 端有188个碱基重合，且有poly(A)尾 初步判断3′ 端的扩增是成功的 5′ RACE 引物设计 5′ RACE Outer Primer: 5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA- 3′ HS4-1-GSP3 (Outer Primer): 5′-AGGCGGTGTGTTATCAGATTGCT-3′ 5′RACE Inner Primer: 5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG- 3′ HS4-1-GSP4 (Inner Primer): 5′-GTGTCCCACTTTTCGTTCTCCGTAGC-3′ 5 RACE PCR结果 5’RACE 割胶回收及菌落PCR结果 SjCaβ 5 RACE测序结果 序列长为879 bp 经过序列比对得到此序列的3′ 端与SjCaβ序列保守区的5′ 端有281个碱基重合 因此可初步判断5′ 端是扩增成功的 把上述三段序列拼接并校正后，得到SjCaβ cDNA基因全长1867 bp 将该cDNA 序列提交至GenBank（GenBank accession number: EU853658） SjCaβ的生物信息学分析 利用NCBI的ORF Finder分析，SjCaβ全长cDNA中，5′ 非编码区（UTR） 179 bp，3′ UTR 74 bp，开放阅读框