[医药卫生]第4次：细胞分离与纯化和细胞系、细胞克隆060209.pptVIP

B.葡聚糖凝胶G-10过柱法 4.基于不同黏附特性的细胞分离方法 葡聚糖（sephadex）是葡萄糖的聚合物，在水中膨胀时可形成凝胶。葡聚糖G-10凝胶具有极小的微孔，常用于分离生物大分子，但也可用来分离细胞。 其分离细胞的原理是：利用细胞的黏附特性，使之黏附于葡聚糖凝胶从而将异质性细胞悬液中的具黏附能力的细胞去除。 C.羰基铁粉法 用羰基铁粉处理，能有效地去除异质性细胞悬液中具有黏附能力的细胞。 该法的基本原理是：把铁粉加入异质性细胞悬液中后，具有黏附活性的细胞将黏附于铁粒子，在器皿外用磁铁将铁粒子连同黏附其上的细胞吸至底部，收获细胞悬液，即为去除了黏附细胞的细胞制剂。 此法通常用于去除免疫细胞悬液中的单核／巨噬细胞。在此情况下，单核／巨噬细胞可吞噬铁粒子，这一特性也有助于将其清除。 4.基于不同黏附特性的细胞分离方法 D.尼龙毛分离法 尼龙毛(nylon wool)就是聚酰胺纤维。应用尼龙毛柱可从混合白细胞悬液中获得富含T淋巴细胞的制剂。 其基本原理是：B淋巴细胞和单核／巨噬细胞易黏附于尼龙毛表面，当白细胞悬液通过尼龙毛柱时，B淋巴细胞、浆细胞及单核／巨噬细胞将黏附于柱上，而无黏附能力的T细胞则通过柱子，收集流出的细胞即获T淋巴细胞。 此法主要用于从淋巴细胞中分离T淋巴细胞和B淋巴细胞或从白细胞或单个核细胞中纯化或去除T淋巴细胞。 5.利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法 根据细胞表面标志的不同，利用相应的抗体特别是单克隆抗体和配体，已经建立了多种基于亲和原理的细胞分离纯化方法。 从理论上讲，根据表面标志的细胞分离方法应该是获得高纯度细胞群或细胞亚群的最可靠、最有发展前途的分离技术，而实践也证明的确如此。 A.免疫溶解法 B.盘化法 C.凝集素凝集法 D.玫瑰花环分离法 E.流式细胞分选术 F.免疫磁珠分离技术 5.利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法 A.免疫溶解法： 免疫溶解法也称免疫消除法。当补体存在时，用抗细胞某一表面标志的特异性抗体与异质性细胞一起孵育，可以使具有该特异性表面标志的细胞溶解。利用这一原理，将待消除细胞的特异性表面标志的抗体和补体加入细胞悬液或细胞培养物中，使抗体及补体作用于具相应抗原的细胞并溶解之。 B.盘化法（panning） ： 是一种在固相表面进行亲和分离细胞的技术，它利用蛋白质分子可吸附于聚苯乙烯塑料表面和抗原一抗体或配体一受体特异性结合的原理，以聚苯乙烯塑料作为亲和剂的不溶性基质，将抗体（或抗原）、配体（或受体）蛋白吸附于其表面，加上异质性细胞悬液，带有相应表面抗原或表面受体（或配体）的细胞将结合于塑料表面，从而将其从异质性细胞悬液中分离出来（阳性选择）或除去（阴性选择）。 5.利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法 C.凝集素凝集法： 凝集素(lectin)是一类以两价或多价与糖结合的非酶非抗体蛋白质，能凝集具有一个以上相应互补性糖类的细胞或其它物质。细胞表面能与凝集素结合的结构称为该凝集素的受体，通常为膜蛋白，但凝集素是对糖特异的，一般只与糖蛋白或多糖的末端非还原糖基反应。几乎所有的细胞都存在一到几种凝集素的受体，而不同类型细胞往往具有不同凝集素受体。根据细胞表面凝集素受体的不同，可采用不同的凝集素使之凝集而与其它细胞分离开来。原则上讲，所有细胞，包括细菌细胞及单细胞原生动物，都可以采用不同的凝集素来进行分离纯化。 D.玫瑰花环分离法： 某些细胞如人T淋巴细胞具有异种红细胞的受体，在一定的条件下，T淋巴细胞可与红细胞相互识别而结合，形成一个T淋巴细胞被数个红细胞围绕的现象，在显微镜下观察宛如一支玫瑰花，故形象地称为玫瑰花环(rosette)。 E.流式细胞分选术： 流式细胞仪（flow cytometer, FCM）是一种将流体喷射技术、激光技术、空气计数、γ射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的仪器，流式细胞术（flow cytometry）就是应用FCM检测、分析生物颗粒（包括细胞）的物理和／或化学特性或借这些特性进行分离纯化的技术。 FCM是随着计算机科学、激光技术、流体力学、单克隆抗体制备、定量细胞化学和定量荧光细胞化学等方法和技术的应用而日益完善的，其检测分析对象范围越来越大，如大的免疫复合物、病毒、脂质体、细胞器、原核细胞、真核细胞以及某些简单的多细胞生物，而且对所有生物都普遍适用，已广泛应用于生命科学的几乎所有分支学科，特别是细胞生物学、肿瘤学、免疫学、血液学、药物学等的研究。 目前，流式细胞术主要用于细胞的定性、定量研究。 5.利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法 F.免疫磁珠分离技术： 免疫磁性微珠（简称免疫磁珠）是以直径几个微米的磁性微珠作为载体，将抗体或抗原结合在此载体