彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤 - 南华大学预防医学与放射卫生实验 b...b.pptVIP

目的 掌握彗星电泳的原理 熟悉彗星电泳的操作方法 掌握彗星电泳的评价方法 原理 单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE)是由Ryberg B和Jonhanson K J首先提出后又经Singh N P和Olive P I进一步完善的一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法。因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验(comet assay)。它是一种测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术，与传统方法相比，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记，具有极高的实用价值。目前该技术已广泛地应用于体内、体外各种有核细胞经受试物诱导的DNA损伤和修复的研究 。 步骤 γ射线照射细胞后，分别于照射后0h，30’，1h，2h，4h收集细胞并做细胞计数，以适量PBS重悬细胞； 胶片制备 取100 ul 用微波炉熔解的 1%正常熔点琼脂糖(NMA)滴在预热的(45℃~70℃)磨砂载玻片上，迅速盖上干净的盖玻片，4℃ 15分钟，(第一层) 将琼脂糖凝固后，取下盖玻片。将细胞悬液（约3000个cell/片）与180ul0.65%低熔点琼脂糖溶液在37℃混匀后，取一半液体滴在第一层的琼脂糖上（2个/载），盖上盖玻片，4℃，15min.( 第二层越薄越好，使细胞尽量在一个平面上) 取下盖玻片，在第二层上滴加60ul0.65%低熔点琼脂糖，4℃，1