小鼠肝脏rna的抽提纯化与鉴定【精品课件】.ppt

小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定 实验目的 掌握RNA操作注意事项 了解鉴定RNA含量和质量的方法 了解RNA抽提原理 熟悉RNA抽提方法 实验原理 理论基础: 真核生物结构基因有内含子 基因在转录水平的表达 实验原理:四步骤 组织或细胞匀浆 分离总RNA 纯化RNA 检测RNA的纯度及完整性 理论基础 真核生物中绝大多数基因有内含子,如直接由基因组克隆目的基因,不利于编码基因的序列分析及体外利用原核细胞表达。提取RNA并逆转录形成cDNA或构建cDNA文库是获取真核生物表达基因的主要手段。 检测基因在转录水平的表达,需检测mRNA含量,定量RT-PCR是主要方法之一。 实验原理 抽提RNA的关键在于去除DNA与蛋白质,常用酸性酚法。在酸性条件下苯酚可溶解DNA而不溶解RNA,同时酚又是蛋白变性剂。利用酸性酚试剂加氯仿共抽提,可一步完成细胞的裂解以及蛋白质与RNA的分离。最后利用异丙醇沉淀,即可获得纯化的总RNA。 RNA产物的鉴定 RNA的纯度与含量用紫外分光光度法检验。 高纯度RNA的A260/A280应处于1.6至1.8之间, A260与RNA浓度呈正比,1 OD = 40μg/ml RNA。 RNA的完整性可通过电泳检测 RNA为单链分子,二级结构复杂,需先经甲酰胺变性,再进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。 细胞总RNA以rRNA含量最高,电泳时可观察到18S与28S rRNA两条清晰条带,且亮度之比接近1:2,表明RNA没有发生降解。泳道前缘还可观察到一条较为模糊且亮度较弱的条带,主要由5S、5.8S rRNA 与tRNA组成。 RNA电泳结果示意图 RNA电泳结果凝胶成像图 取小鼠肝组织匀浆 处死小鼠 匀浆 RNA纯化操作步骤 加入氯仿0.2ml,剧烈振荡,室温放置10分钟。12000rpm离心15min,取上清。 (离心后溶液分为三相,即上层的水相、下层的有机相以及中间的变性蛋白。小心吸取上层水相,绝不能有中层蛋白混入。) 加入异丙醇0.5ml,振荡混匀,室温放置10分钟,12000rpm离心10min,弃上清。 (加入50％的异丙醇沉淀核酸。异丙醇的用量应与以上所取上清液的体积相当。) 1ml 75％乙醇洗涤沉淀,12000rpm离心5min,重复一次。 空气干燥沉淀,溶解于20μl DEPC-H2O。留样2μl,其余－70℃保存备用。 RNA电泳操作步骤 制备琼脂糖凝胶:首先将0.5g琼脂糖溶化于32ml水,冷却至60℃。加入5×甲醛变性凝胶电泳缓冲液10ml,37％甲醛水溶液9ml,混合均匀并灌制胶板。 取1μl RNA溶液,加入甲酰胺-上样缓冲液9μl,95℃变性5分钟,迅速冰浴冷却。点样。 150V电泳30分钟,紫外灯下观察电泳结果。 分光光度法操作步骤 加1μl RNA溶液于0.4ml DEPC-H2O,充分混匀,读取260nm与280nm的吸光度数值。 操作注意事项(一) 因为RNA酶分布广、活性强、且难以失活, 使RNA极易降解,操作时应特别注意: 高压消毒实验器皿,烤干。 以0.1﹪ DEPC过夜处理所有试剂配置用水,并高压消毒。 抽提RNA时,应戴手套和口罩,少说话。 操作注意事项(二) DEPC是强烈的烷化剂,通过与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制RNA酶活性,是消除外源性RNA酶的主要方法。但CEPC有致癌作用,并具有很强的反应性,因此注意: 使用时,不直接接触 DEPC处理的器皿和水必须经高压灭菌处理,使DEPC分解后使用。 操作注意事项(三) 为避免酶蛋白反复冻溶而失去活性,酶制剂溶于50％的甘油中,-20oC储存可保持液状。但高浓度的甘油对酶促反应有抑制作用,因此酶的用量不能超过反应体积的1/10。 在进行各种酶促反应时,应首先加水,再加入其它成分,最后加酶。 * * 内含子 外显子 28S 18S 5S 28 S 18 S 5 S 取肝50~100g Trizol 1ml 匀浆