层析分离纯化技术.ppt.ppt

生命科学与生物技术 生物分离技术 基因重组技术 免疫检测技术 层析的起源和原理 起源1906年，俄国植物学家Tsweet 原理利用物质分配系数不同达到分离 目的 液相层析 最广泛的蛋白质分离纯化方法 条件温和 维持蛋白质空间结构与活性 基于蛋白质对固定相的不同保留达到分离 蛋白质溶于流动相中，经过装填固定相的柱子分离 非常直观，易学 简单明快，4个步骤进入操作： Browser? Setup ? Protocol ? Run 观察样品情况,调节色普图和峰高度 or Go Do Something Else! 快速启动功能：2 次击键进入操作 Browser? Run 观察样品情况,调节色普图和峰高度 or Go Do Something Else! Manual Screen Browser – Enter User and Method Name Setup –select hardware Protocol – enter method Post Run Options - Activity Post Run Options–Peak Tagging 纯化平台的硬件结构—— 层析介质与层析柱，原理与技术 1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30 2.脱盐 Columns Media Bio-Scale Q Macro-Prep high Q Bio-Scale DEAE Macro-Prep DEAE Bio-Scale S Macro-Prep high S Bio-Scale CM Macro-Prep CM Macro-Prep 25 Q Macro-Prep 25 DEAE Macro-Prep 25 S UNO Q UNOsphere Q UNO S UNOsphere S 更高的选择性和分辨率 10% 穿透载量: Unosphere Q: 150 mg/ml BSA @ 600 cm/hr Unosphere S: 30 mg/ml BIgG @ 600 cm/hr 高流速，低反压 －操作压力: 2 bar @ 1200 cm/hr with 20 cm 更高的碱稳定性 短期 : 1.0 M NaOH @ RT for 1 week 长期 : Storage in 0.1 M NaOH @ RT for 1 year 生产效率大大提高 Ca10(PO4)6(OH)2 5 个带正电荷的Ca离子对（C位点） 2 个磷酸三价离子，每个含有带6个负电荷的氧原子（P位点） 2 个羟基 于其他层析介质不同，CHT的骨架是化学反应的表面 初级保留机制 蛋白质带正电氨基 经典的阳离子交换 用中性盐溶液 (NaCl) 或缓冲盐溶液 (PO4)洗脱 初级保留机制 带负电羧基 经典的金属螯合作用，并受离子排阻调节 比离子间静电相互作用强15–60倍 在无PO4 条件下不能被任何浓度NaCl洗脱 用PO4洗脱 混合保留机制 大部分大分子蛋白质以两种保留机制联合模式结合：Ca亲和与阳离子交换 酸性蛋白质的结合，如白蛋白（albumin）以钙亲和作用为主，阳离子交换仅有轻微的作用，这意味着NaCl对白蛋白载量和保留的影响是非常有限的。 碱性蛋白质，如IgG以阳离子交换作用为主，其载量和保留受NaCl影响显著 如何选择类型 基于生物分子表面疏水性不同而达到分离的技术 疏水作用来自于分子的水化结构，高浓度盐溶液破坏生物分子的水化结构，使蛋白质内部的疏水基团暴露于分子外表面，从而可与疏水介质结合 不同离子的疏水性 Anions: SO42- Cl- Br- NO3- ClO4- I- SCN- Cations: Mg2+ Li+ Na+ K+ NH4+ 蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以低浓度盐溶液洗脱 Affinity Chromatography Profinity IMAC——纯化His-tagged Protein Chelex 100——纯化DNA，PCR样品制备 Affi-Gel Protein A——纯化单克隆抗体 Dye - Affi-Gel Blue (DEAE or CM) ——纯化单抗，分离HSA Affi-Gel 肝素凝胶——多种蛋白，如凝结因子、蛋白酶、核酸酶、脂酶 Affi-Gel Poly