Ch6-细胞重组与克隆动物.ppt.pptVIP

一、细胞重组1.细胞拆合 ☉细胞拆合即细胞组分的分离与融合，是指将细胞分为核和质两部分，还包括微细胞的诱导和中期染色体的分离。 ☉诱导核质分离和产生微细胞需用特殊的试剂——松胞素B。 松胞素B又称细胞松弛素B(cytochalasin B,CB)。是一种真菌的代谢产物。1967年发现CB可以诱导离体培养的小鼠L细胞去核。 2.细胞组分的分离 ☉ 胞质体（cytoplast）指去核后的细胞。能保持细胞的原形，具有除核以外的细胞器，不能合成DNA和RNA，但能合成蛋白质。 ☉ 核体（karyoplast）或称小细胞（minicells），指细胞分离出来的核。外包有质膜和少量细胞质，在一段时间内能合成DNA和RNA。 ☉ 微细胞（micocells）秋水仙素将细胞分裂阻滞在中期，细胞不能分裂，一条或几条染色体组装成为微核，再用松胞素处理，微核突出细胞膜外，可获得微细胞。 3.细胞重组方式 ☉ 细胞质杂种(cybrib)——由胞质体与完整细胞融合而成。 胞质体——带有氯霉素抗性（CAPR）的小鼠L细胞的胞质体。 完整细胞——对氯霉素敏感（CAPS）、但具有BudR抗性（BudRR ）的小鼠L细胞亚系。 胞质杂种——可以在具有氯霉素和BudR的培养基中存活。 图6-1 胞质杂种的产生 ☉ 微细胞异核体(micocell heterokaryons)——由微细胞与完整细胞融合而成。 微细胞只含有单个或几个染色体，是进行遗传物质转移的适宜工具。 微细胞异核体经分裂也是体细胞杂种，是研究基因定位、基因表达的好材料。 图6-2 微细胞的形成（一） 图6-3 微细胞的形成（二） ☉ 重组细胞(reconstituted cell)——用一种细胞的胞质体与另一种细胞的核体融合而产生。 重组细胞的鉴定方法： ¤放射性同位素标记法 用3H-TdR标记细胞核供体，用3H-Leu标记细胞质供体。 融合细胞作放射自显影，如果胞质和胞核都有放射性银颗粒，而核的颗粒大而深、胞质银粒较细，即为重组细胞。 图6-4 同位素标记法鉴定重组细胞 ¤ 综合标记法 用大乳胶颗粒标记胞供体（HPRT-）,去核后得胞质体（去核细胞）； 用小乳胶颗粒标记核供（HPRT＋）,得小细胞（核体）； 胞质体（大乳胶颗粒）与小细胞融合成重组细胞； 胞质体（大乳胶颗粒）与核供体细胞（小乳胶颗粒、HPRT＋）融合成胞质杂种。 图6-5 重组细胞与胞质杂种的鉴别 二、细胞核移植 在细胞重组的几种方式中，胞质体与核体的重组，即核移植技术(nuclear transplantation)最令人关注。 1.鱼类和两栖类的核移植 ☉ 1938年，德国胚胎学家汉斯.施佩曼（Haus Speman）提出：“在两栖动物中，8细胞以前的胚胎具有发育的全能性”的观点。并提出奇异的设想：把一个细胞的细胞核取出，然后把取自另一个发育到后期的胚胎的细胞核放入这个卵细胞中。 ☉1952年，美国学者罗伯特.布里格斯（Robert Briggs）等，将豹蛙发育到囊胚期的胚胎细胞做移植试验，成功获得可摄食的豹蛙幼体。  ☉1958年，英国学者约翰.格登(John Gurdon)等，利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培养出可育的爪蟾。 ☉1961年，我国学者童第周等进行鱼类不同亚科间细胞核移植获得成功。 表6-1 移核后卵子发育的实验 ☉1978年，童第周等将黑斑蛙成体红细胞的细胞核移入去核的未受精卵内，卵子正常发育成蝌蚪（红细胞这样高度分化的细胞，在特殊条件下，也可重新表达）。 ☉1979年，武汉水生所，将鲫鱼囊胚期细胞经过385天59世代连续继代培养后，再将此培养细胞的细胞核移植到同种鲫鱼的未受精卵中。1984年，培养出两尾无性繁殖的幼鱼，其中一条发育正常，80多天长到8cm 。 ☉1989年，童第周等将鲫鱼胚胎细胞核移入去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，无性繁殖出“鲤鲫核鱼”。 2.哺乳类的细胞核移植 两栖类实验材料具有卵数量多、容易取得、体积较大、操作方便等优点，而哺乳动物的卵细胞直径小，鼠卵直径为100μm、兔卵125μm、牛卵140μm、人卵100μm 。核移植需在显微操作仪(micromanipulator)下进行。 ☉1977年，美国杰克逊实验室的 “亚无性繁殖” 实验 （1）受精卵在