HBsAg免疫对小鼠 T、B细胞功能的影响_16096.pptVIP

吉林大学基础医学院免疫学教研室 吉林大学基础医学院免疫学教研室 系 统 实 验 之 二 T淋巴细胞功能测定 袁红艳 hongyanyuan@ 实 验 流 程 1W 1.双向免疫扩散④ 2.酶联免疫吸附试验（ELISA) ⑤ OVA (1mg/ml)+CFA（500ul）免疫小鼠（腹腔内注射） OVA+CFA （500ul）加强免疫小鼠① 无菌取脾和胸腺② 摘眼球取血 分离血清② 2W 取脾和胸腺② 淋巴细胞转化试验② ③ 生理盐水（500ul) 免疫小鼠（腹腔内注射） 生理盐水（500ul） 加强免疫小鼠 ① 2W 1W 对照组 实验组 抗体效价 增殖功能 实验内容 小鼠摘眼球取血、分离血清 淋巴细胞转化试验（一） 教学要求 掌握小鼠血清的分离 掌握淋巴细胞转化试验的基本原理及基本操作 淋巴细胞转化试验 (Lymphocyte transformation test) 原理 检测方法 操作步骤 应用 实验分组及材料 器材 酒精棉球 若干 无菌纱布块 1块/组 无菌平皿 1块/组 无菌吸头（大、中、小）4盒/room 无菌96孔培养板 1块/组 可调微量加样器 4套/room 细胞计数板 1套/组 显微镜 1台/组 EP管 若干 眼科剪、小镊子 4套/room 细胞培养箱（37℃ 5%CO2) 酶标仪 离心机 2个/room 超净台 2个/room 动物及试剂 小鼠 2只/组(NS,OVA) 培养液（IMDM) 无FCS 100ml/room 培养液（IMDM)20%FCS 30ml/room ConA（2.5,5,10μg/ml) 各1.5ml/tube 白细胞计数液（2%冰醋酸）2瓶/room MTT（5mg/ml) 1.5ml/room 二甲亚砜（DMSO) 5ml/组 分组： 每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏 免疫血清分离过程 摘眼球取血 RT for 2hrs Rotation 2000rpm for 20min Transfer serum to a new EP Double diffusion Store at 4℃ ELISA 1.5ml EP 淋巴细胞转化实验步骤 单细胞悬液的制备： 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。 于超净台内取出脾和胸腺组织(各1/2)，分别放入预先盛有2ml IMDM培养液的平皿内。 将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000μl加样器隔着纱布将细胞悬液吸出，放入1.5ml EP管中。 细胞计数： 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20μl，加到盛有980μl计数液的EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。 调细胞浓度至1×107/ml，所需量为1.5ml，设需要的细胞悬液体积为Aml,可按公式：?/ml×A=1.5×1×107 NOTE:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。 细胞计数板 查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y ×104×稀释倍数(50) 4 细胞培养： 按图所示加样。 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%C02培养箱中，培养48小时。 MTT掺入：（隔一天 下午） 在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。 每孔内加入MTT（5mg/ml) 10μl，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混匀。 在37℃ 5%C02培养箱中继续培养2小时，轻轻吸弃上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。 加入100μl 二甲亚砜（DMSO)，将颗粒溶解。 结果测定： 结果测量：用酶标仪测定光密度值A570nm（用空白孔调零），记录结果。 结果判定： SI（刺激指数）=Con A刺激孔 A值 / 对照孔A值 预习内容 自讲自评内容： 1.细胞因子检测技术 (理论教材P257–P258) 2.单克隆抗体制备技术 (理论教材P68;实验教材P106-P109) 课次 自讲内容及讲解时间 参考教材 备注 一 （10.6） 1. 抗体制备技术。（20min） 实验教材P100-P103 抗体纯化、单克隆抗体制备、基因工程抗体除外。 2. 免疫细胞分离及其功能检测。（45min） 理论教材P251-P255 实验教材P70-P80 P255:从NK…… 以后除外。 三 （10.15) 3. 细胞因子检测技术。（45min） 理论教材P257–P258 4.