现代生物技术第七章 基因克隆策略与转基因技术.pptVIP

第七章 基因克隆策略与转基因技术 基因克隆和转化技术是基因工程操作的主要组成部分，没有克隆就无法开展基因工程，没有简单有效的转化技术就难以实现外源基因的遗传重组。随着分子生物学技术和相关学科的发展，基因克隆和转化的新技术、新方法不断涌现。因此，有必要进一步了解这些技术方法的原理、操作和优缺点及其对因材选法，提高基因克隆和转基因效率的意义。 第一节 基因克隆策略 一、一般克隆法 (一)化学合成法 一般方法是先将寡核苷酸激活，带上5’磷酸基团，然后再与相应的互补的寡核苷酸片段退火，形成带有黏性末端的双链寡核苷酸片段。把这些双链寡核苷酸片段混合在一个试管中，加上T4DNA连接酶，使它们彼此连接组装成一个完整的基因或基因的一个片段。这些组装的产物被插入到适当的载体上，并转化大肠杆菌寄主细胞。最后DNA序列分析所组装的基因。应用这种基因组装法，已经克隆出了多种基因，其中包括分子量较大的α干扰素和组织纤溶酶原激活因子(tpA)等多个基因。 (一)化学合成法 化学合成法关键是：①最好在基因两个末端设有不同酶切位点，以便与载体进行有方向性的连接。②合成的片段应该经过适当纯化，一般以PAGE或HPLC纯化较好，因为合成过程中有些片段不完整，必须除去。③片段5’端不宜过长，因为越长，成本越高，产量越低，而且出现错误的几率越大。⑤连接时，应每四个两两互补片断一同连接，然后每两组相连，最后和载体连接。⑥转化克隆后，必须分析序列，予以确证。 （二）DNA基因文库 1．原理 通过一系列的酶促反应，使总Ploy(A)mRNA转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子，然后再转化到大肠杆菌寄主菌株的细胞内，如此便构成了包含着所有基因编码序列的cDNA基因文库(complement DNA gene library)。广泛使用的一种方法是，先用逆转录酶合成一条cDNA链，经碱降解作用，再用大肠杆菌DNA聚合酶I合成第二条链，最后用单链特性S1核酸酶消化掉cDNA单链部分，形成双链的cDNA，与载体连接后，转化宿主细胞，产生千万个克隆，即为cDNA文库。 2．不同丰度mRNA的cDNA克隆 在许多组织和细胞中，各种mRNA的含量都是极不相同的。其中，有些类型的mRNA含量十分丰富，每个细胞可拥有数干个拷贝，而有些类型的mRNA每个细胞只有少数几个拷贝。 对于稀少mRNA，可以通过蔗糖梯度离心及变性条件下的凝胶电泳，分离以后富集。也可以根据已知核酸序列，合成互补的核苷酸序列，在Ploy(A)RNA的逆转录反应中，这些寡核苷酸序列可以作为引物，合成cDNA并建成文库。如果合成的寡核苷酸有足够的长度(14～40个核苷酸)，还可直接作为探针，从cDNA基因文库中筛选含有目的基因序列的克隆。 3．cDNA克隆特点 ①cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病毒，例如流感病毒，cDNA克隆就成为一种惟一可行的方法。 ②cDNA基因文库的筛选比较简单易行，一个完全的cDNA基因所含的克隆数，要比一个完全的基因组文库所含的克隆数少得多。理论所必需的最低克隆数，约为1.7×105个克隆。 ③如果某一特定的基因克隆，目的在于获得一种特殊的真核蛋白质产物，涉及它的蛋白质的检测，则必须用cDNA库法。 ④在已知基因组DNA序列酌情况下，通过同cDNA序列的比较，还可以确定出内含子和外显子之间的界线。另外，cDNA片段小，序列分析方便。 ⑤在发育过程中时间调节基因表达特征的分析，以及组织特异性基因表达特性的分析，都要使用cDNA克隆。 ⑥鉴定出在某种类型细胞中存在，而在同种类型细胞不同处理中又不存在的mDNA分子的cDNA克隆，如差异显示等。 ⑦用cDNA文库制成表达芯片很容易进行基因表达分析。 (三)基因组文库 基因组文库是指由来自染色体DNA的全部DNA片段组成的基因文库。理论上，在一个完整的基因组文库中，生物体的每一个基因都有一个克隆。 构建基因组文库的第一步是，从目的生物体中制备基因组DNA，根据建库所用载体容量大小制备适宜的DNA片段。应注意的是，分离的DNA片段最小应为载体容量的2倍以上。 构建基因组文库的第二步是，在体外将这些DNA片段同适当的载体连接，形成重组体分子，转化大肠杆菌细胞，经过生长扩增之后，组成了一个重组体克隆库，此即是基因组文库。一个构建理想的文库，应该对任何一个已知基因均可从文库中筛选出来。 关于基因组文库的几个要点： ①使用任何一种扩增的基因文库时，同一重组体群体中所有的成员都不是等速地增殖。插入的外源DNA在大小及序列上的差异，将影响到重组载体的复制速率。这样，当一个基因文库经过了扩增之后，某些特定的重组体的比例就可能增加，而有些重组体的比例则可能下降，甚至会丢失。 ②用已知探针筛选出阳性克隆，并不一定是单一的完