台州市手足口病采样和实验室检测技术要点.docVIP

附件5 台州市手足口病采样与实验室检测技术要点 引发手足口病的肠道病毒有20多种，包括柯萨奇病毒A组、肠道病毒71型等，其中最常见的病原为肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇A16型(Cox A16)。为规范我省手足口病采样与实验室检测各项工作，按照卫生部《手足口病预防控制指南（2008年版）》和省中心有关文件要求，制订本技术要点。 一、标本采集及注意事项 （一）标本采集对象：⑴危重病例和死亡病例；⑵住院病例；⑶聚集性病例（学校与幼托机构一周内出现2例及以上病例）；⑷以乡镇为单位首发病例。 （二）采样时间：用于病毒核酸检测及分离的标本采集尽可能在发病的初期，急性期或患者入院的当天进行，同时最好在感染的急性期和恢复期采集用于抗体检测的双份血清（相隔2～4周）。 （三）标本种类；用于检测的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本。对于血清学诊断，需要在急性期和恢复期采集双份血清标本。 （四）采样液：常用的采样液有以下几种： pH7.4～7.6的Hank’s、Eagle’s、水解乳蛋白液或不加抗菌素的生理盐水（漱喉液）。为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中需加入抗菌素，加入庆大霉素，其终浓度为0.1mg/ml,和抗真菌药物，其终浓度为2mg/ml。加入抗菌素以后重新调节pH值为7.4，配制好以后，分装每个采样管2-3ml,-20 （五）采集方法 1.疱疹液：可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有1-2 ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 2.粪便：采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5~8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 3.脑脊液：出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0~2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 4.咽拭子：采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 5.含漱液：用5-6 ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理盐水在咽部转动，尽可能在咽喉深部反复含漱，然后用平皿、烧杯或一次性杯子收集洗液，倒入15ml带螺旋盖内有橡胶圈试管里，旋紧盖子。 6.血清标本：采集急性期（发病0~3d）和恢复期（发病14~30d）双份配对血清用于抗体检测。静脉采集3~5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于－20℃以下冰箱中冷冻保存。 （六）标本采集注意事项 用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。在采集咽拭子及漱口液前半小时内不要喝水，以保证采样质量。漱口液中严禁加入抗生素，以防过敏。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。 二、标本的保存与运输 (一)保存：病毒抵抗力弱，室温中容易灭活，因此样本采集后要尽快送检，标本可暂时（数小时）保存在0～4℃低温环境中，或放置在－20℃的冰箱中。长期保存时标本不经稀释，直接冻存于在 （二）运输：标本应在 ￡4℃条件下，由专业人员使用标本运送箱尽快送至实验室。若不能在24小时内送达，则应尽快保存在－70℃以下低温冰箱，如无－70℃ 三、病毒核酸检测 病毒核酸快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于病毒性疾病暴发疫情的早期病原学检测。 （一）样本处理 脑脊液标本无需处理，咽拭子、含漱液或疱疹液样本均需充分混匀，室温静止10分钟，取上清液200μl用于病毒核酸提取。粪便样本用生理盐水或PBS制成20%粪便悬液，即1克粪便加5毫升PBS，充分混匀，4500转/分，离心20分钟， 取上清液200μl用于提取病毒核酸。 （二）病毒核酸提取 试剂盒：采用RNA RNeasy min