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分子生物学实验-实验1 DNA重组和细胞转化2015
* pBR322 pSV 3.5kb BamH I Xba I c-myc DNA片段 4.8kb T4DNA连接酶 大肠杆菌E.coli DH5α CaCl2法 感受态细胞 转化 Amp平板 转化 推板 孵育过夜 8.5kb BamH I Xba I pSV * pSV-c-myc BamH I Xba I c-myc基因片段4.8 kb pSV2载体片段3.5kb pSVcmyc1 [pmetD] (ATCC? 41029?) -TCTAGA- -AGATCT- 粘性末端 防止载体的自身环化 目的基因定向插入 * 目的基因(c-myc基因片段)的获取 c-myc基因是myc基因家族的重要成员之一 c-myc基因与多种肿瘤发生发展有关 本实验采用的4.8kbc-myc基因位于2,3外显子区域 BamH I 和Xba I 双酶切处理 * 载体与目的基因的连接构建重组子 1. 平端连接 增加DNA浓度或提高连接酶浓度以提高连接效率 2. 粘端连接 效率较高,加入连接酶后可立即转化,即有转化子出现 3. 粘-平连接 * 连接酶的选择: T4 DNA连接酶:适用粘端、平端连接 可用于DNA-RNA,RNA-RNA杂交体 大肠杆菌DNA连接酶:适用粘端连接(也可用于平端,效率低) 连接温度: 一般12~16 ℃,也可提高温度到22 ℃ 载体与目的基因的比例: 摩尔比约1:1 ~ 1:5 * 转化:将异源DNA分子引入另一细胞,使受体细胞获得新的遗传性状。 感受态细胞:受体细胞经特殊方法(如电击、CaCl2等处理,细胞膜的通透性发生改变,允许带外源DNA的载体分子进入的状态,称之。 转化体的筛选:选择性培养基 如:Amp抗性平板 目的基因片段(4.8kb),20ng/μl 4.5 μl 载体DNA(3.5kb), 12ng/μl 4.0 μl 10 × 连接buffer 1 μl T4 DNA 连接酶(10U/ μl) 0.5 μl 总体积: 10 μl 混匀,16 ℃ 水浴中温育2~4小时,4 ℃保存备用。 四、实验步骤(详见实验讲义) 1. 目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接(粘端) * 注意: 加样前短暂离心 加样顺序 保证每个样品加入其中 加样完成后混匀后离心 2. CaCl2法制备感受态细胞 * 注意: 最好在超净工作台内进行,或火焰旁5cm无菌圈 注意无菌操作和冰浴 离心前必须平衡 * 倒入经冰预冷的15mL离心管,冰浴10min 37 ℃ 振摇约2h,细菌长至云雾状 取0.1mL大肠杆菌HB101培养物,加至5mLLB培养液中 4℃ ,4000rpm,离心10min 弃上清,在纸巾上倒置1min,重悬于200μL 0.1mol/L CaCl2 分装成50 μL /管 沉淀重悬于冰预冷的1mL,0.1mol/L CaCl2 ,混匀 转入1.5mL离心管,冰浴10min 4℃ ,4000rpm,离心10min 弃上清,在纸巾上倒置1min 3. 重组质粒转化感受态细胞 * 5μL连接产物或阳性对照质粒1μL分别加入50 μL感受态细胞,冰浴30min 42 ℃ 90sec 立即冰浴1~2min 分别加入LB培养液 150 μL ,37 ℃ 振摇45min 分别取200μL/100μL铺板于含Amp的LB平板 转移要快,温度要准确 37 ℃ 温箱培养过夜 影响转化效率的因素 1. 感受态细菌的效价 2. 转化的条件 3. 质粒DNA与受体菌的比例 * * 结果观察: 次日取平板观察 4 ℃保存备用 下次实验:重组DNA的提取及其酶切鉴定 下周实验课前一天(5月6日)下午3:30~4:00挑克隆,过时不候 * 示教: 挑克隆 思考与疑问: 1. 做感受态时,为何要在冰浴下进行? 微生物培养时一般培养基中的水分含量较高,且培养温度一般较高,如果不将培养皿翻转,培养基中的水分会挥发出来,造成培养基中的水分损失,另外,挥发出来的水分会在培养皿盖子上凝结成水珠,水珠
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